Hauptunterschied – Genklonierung vs. PCR
Die Synthese vieler DNA-Kopien aus einem bestimmten DNA-Fragment wird als DNA-Amplifikation bezeichnet. Es gibt zwei Hauptverfahren zur DNA-Amplifikation, nämlich Genklonierung und PCR. Der Hauptunterschied zwischen Genklonierung und PCR besteht darin, dass die Genklonierung mehrere Kopien eines bestimmten Gens in vivo herstellt, indem eine rekombinante DNA konstruiert und in einem Wirtsbakterium gezüchtet wird, während PCR Millionen von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments in vitro produziert, das wiederholten Zyklen unterzogen wird Denaturierung und Synthese.
Was ist Genklonen?
Genklonen ist eine Technik, die verwendet wird, um ein bestimmtes Gen aus der extrahierten genomischen DNA eines Organismus durch die Konstruktion rekombinanter DNA zu lokalisieren und zu vervielfältigen. Genomische DNA enthält Tausende verschiedener Gene, die für Proteine kodiert sind. Wenn DNA extrahiert wird, enthält sie alle möglichen Gene, die sie tragen kann. Die Genklontechnik hat den Nachweis eines spezifischen Gens aus der Gesamt-DNA ermöglicht. Daher dient das Klonen von Genen als ein wichtiges Werkzeug in der Molekularbiologie.
Die Erstellung einer genomischen Bibliothek eines Organismus ist beim Klonen von Genen unerlässlich, wenn es keinen Hinweis auf die Position des relevanten Gens in der DNA gibt. Eine genomische Bibliothek wird mit den folgenden Schritten erstellt.
Schritt 1: Extraktion der Gesamt-DNA aus einem Organismus, der das gewünschte Gen enthält.
Schritt 2: Restriktionsverdauung der extrahierten DNA zur Herstellung kleiner handhabbarer Fragmente. Dieser Schritt wird durch Restriktionsendonukleasen erleichtert.
Schritt 3: Auswahl eines geeigneten Vektors und Öffnen der Vektor-DNA mit denselben Restriktionsendonucleasen. Bakterielle Plasmide werden üblicherweise als Vektoren verwendet, um fremde DNA zu tragen. Plasmide sind kleine DNA-Ringe, die sich in Bakterien befinden.
Schritt 4: Kombinieren der Vektor-DNA und der fragmentierten DNA, um ein rekombinantes DNA-Molekül herzustellen. Dieser Schritt wird von der DNA-Ligase gesteuert.
Schritt 5: Transfer rekombinanter DNA-Moleküle in Wirtsbakterien. Dieser Schritt wird als Transformation bezeichnet und erfolgt mit einem Hitzeschock.
Schritt 5: Screening von transformierten Bakterienzellen auf einem Kulturmedium. Am Ende des Transformationsprozesses wird eine gemischte Population von transformierten und nicht transformierten Wirtszellen erh alten. Als Gen von Interesse gilt nur in transformierten Wirtszellen. Daher ist es notwendig, transformierte Zellen auszuwählen. Die Selektion erfolgt unter Verwendung von selektiven Medien, die Antibiotika enth alten. Nur die transformierten Zellen wachsen auf diesem Screening-Medium, was die Selektion ermöglicht.
Schritt 6: Anzucht von Bakterien zur Herstellung einer Genbibliothek. In diesem Schritt werden die transformierten Wirtszellen in frisches Kulturmedium eingebracht, das optimale Wachstumsvoraussetzungen bietet. Die gesamten Kolonien auf den Kulturplatten repräsentieren die genomische Bibliothek dieses Organismus.
Schritt 7: Das rekombinante DNA-Molekül, das das interessierende Gen enthält, muss aus Tausenden von geklonten Fragmenten rekombinanter DNA gescreent werden. Dies kann durch die Verwendung von Sonden erreicht werden, die das spezifische Gen markieren, oder das spezifische Protein ergibt sich aus diesem Gen.
Sobald das interessierende Gen, das die Bakterienkolonie enthält, aus allen Kolonien identifiziert wurde, ist es möglich, Millionen Kopien des rekombinanten Plasmids herzustellen, das das Gen enthält.
Das Klonen von Genen wird verwendet, um Genbibliotheken aufzubauen, spezielle Proteine, Vitamine, Antibiotika, Hormone herzustellen, Genome der Organismen zu sequenzieren und zu kartieren, mehrere Kopien der individuellen DNA in der Forensik zu erstellen usw.
Abbildung_1: Klonen von Genen
Was ist PCR?
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Technik, die eine große Anzahl von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments erzeugt. Die exponentielle Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz wird durch PCR unter In-vitro-Bedingungen erreicht. Diese Technik ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug in der Molekularbiologie, da sie eine kleine DNA-Probe in eine verwendbare Menge multiplizieren kann. Die PCR wurde 1983 von Kary Mullis eingeführt und diese preisgekrönte Erfindung brachte einen enormen Fortschritt in der Molekularbiologie.
PCR-Technik folgt wiederholten PCR-Reaktionen, wie in Abbildung 02 gezeigt. Eine PCR-Reaktion besteht aus drei Hauptschritten, die bei drei verschiedenen Temperaturen stattfinden; Denaturierung von doppelsträngiger at-DNA bei 94 0C, Annealing von Primern bei 68 0C und Strangverlängerung bei 72 0 C. Daher sollte, wenn eine PCR durchgeführt wird, die Temperaturschwankung für eine ordnungsgemäße Replikation hoch geh alten werden. Die PCR wird in einer PCR-Maschine in PCR-Röhrchen durchgeführt. PCR-Röhrchen werden mit den richtigen PCR-Mischungen beladen, die Matrizen-DNA, Taq-Polymerase, Primer, dNTPs und Puffer enth alten. Die Denaturierung von doppelsträngiger Proben-DNA in einzelsträngige DNA erfolgt durch Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen bei 94 – 98 0C. Dann werden Einzelstränge der Matrizen-DNA für Primer freigelegt. Es sollte ein Primerpaar (vorwärts und rückwärts) bereitgestellt werden, und sie sollten thermostabil sein, um hohe Temperaturen zu tolerieren. Primer sind einzelsträngige kurze DNA-Sequenzen, die zu den Enden des Ziel-DNA-Fragments komplementär sind. Bei der PCR werden synthetische Primer verwendet. Primer binden an die komplementären Basen der Proben-DNA und initiieren die Synthese eines neuen Strangs. Dieser Schritt wird durch ein Enzym namens Taq-Polymerase katalysiert; ein aus Thermus auqaticus isoliertes thermostabiles DNA-Polymerase-Enzym. Wenn Primer und Nukleotide (Bausteine) verfügbar sind, konstruiert die Taq-Polymerase den neuen DNA-Strang, der komplementär zur Matrizen-DNA ist. Am Ende des PCR-Programms wird das amplifizierte DNA-Fragment mittels Gelelektrophorese beobachtet. Wenn eine weitere Analyse erforderlich ist, wird das PCR-Produkt aus dem Gel gereinigt.
PCR ist sehr nützlich für die Diagnose und Überwachung von genetischen und erworbenen Krankheiten, die Identifizierung von Kriminellen (auf dem Gebiet der Forensik), die Untersuchung der Struktur und Funktion eines bestimmten DNA-Segments, die Sequenzierung und Kartierung von Genomen von Organismen, usw. Die PCR ist unter Wissenschaftlern zu einer routinemäßigen Labortechnik in medizinischen und molekularbiologischen Forschungslabors geworden, da sie eine Vielzahl von Anwendungen hat.
Abbildung_2: Polymerase-Kettenreaktion
Was ist der Unterschied zwischen Genklonierung und PCR?
Genklonierung vs. PCR |
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| Genklonen ist der Prozess, bei dem mehrere Kopien eines bestimmten Gens in vivo durch rekombinante DNA hergestellt und in ein Wirtsbakterium umgewandelt werden. | Die PCR-Technik produziert mehrere Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz in vitro durch wiederholte Zyklen von PCR-Reaktionen. |
| Erfordernis der Konstruktion rekombinanter DNA | |
| Rekombinante DNA wird hergestellt, um das Gen zu lokalisieren. | Rekombinante DNA wird nicht produziert. |
| Arbeitsbedarf | |
| Dieser Vorgang ist arbeitsintensiv. | Es ist keine intensive Arbeit erforderlich. |
| In-vivo- oder In-vitro-Verfahren | |
| Die Konstruktion der rekombinanten DNA erfolgt in vitro und die Amplifikation der DNA in vivo. | Die Amplifikation von DNA erfolgt vollständig in vitro. |
Zusammenfassung – Genklonierung vs. PCR
Genklonierung und PCR sind zwei Methoden zur DNA-Amplifikation. PCR ist ein In-vitro-Prozess, der mehrere Kopien von DNA eines bestimmten DNA-Fragments herstellt, ohne rekombinante DNA und einen Wirtsorganismus zu verwenden. Das Klonen von Genen ist in erster Linie ein In-vivo-Prozess, der durch die Konstruktion rekombinanter DNA zu mehreren Kopien eines interessierenden Gens im Wirtsorganismus führt. Dies ist der Unterschied zwischen Genklonen und PCR.
