PCR vs. Echtzeit-PCR
PCR oder Polymerase-Kettenreaktion ist eine revolutionäre Entdeckung in der modernen Molekularbiologie, die erstmals 1983 von dem Chemiker Kary Mullis entwickelt wurde. Sie ermöglicht die Amplifikation einer einzelnen Sequenz in einer komplexen DNA für die Analyse. Die Grundidee der PCR besteht darin, dass zwei Primer, die zu den gegenüberliegenden Strängen einer DNA-Sequenz komplementär sind, aufeinander ausgerichtet werden; die Primer erzeugen komplementäre Stränge, die jeweils den anderen Primer enth alten. Das Ergebnis ist also eine große Menge einer Sequenz, die der DNA entspricht, die zwischen den beiden Primern liegt. DNA-Polymerase-Enzym wird verwendet, um die Primer in der PCR zu verlängern. DNA-Polymerase ist ein thermostabiles Enzym und hat die Fähigkeit, bei hohen Temperaturen (94 bis 95 °C), die zur Denaturierung von Matrizen-DNA verwendet werden, zu überleben.
Die PCR umfasst drei Schritte, nämlich wiederholte Denaturierungsrunden, Anlagerung von Primern und DNA-Synthese. Eine Thermocycler-Maschine wird verwendet, um diese Reaktion durchzuführen, damit sie so programmiert werden kann, dass sie die Temperaturen schnell und genau ändert. Anwendungen der PCR sind strafrechtliche Ermittlungen, DNA-Fingerabdrücke, der Nachweis von Krankheitserregern und die Analyse von DNA früher menschlicher Spezies.
Was ist konventionelle PCR?
Es gibt drei Hauptstufen der konventionellen PCR, nämlich; DNA-Amplifikationsstufe, Trennung von PCR und Nachweis von Produkten. Die Trennung von DNA-Segmenten erfolgt typischerweise durch Agarose-Gelelektrophorese. Die Produkte werden dann mit Etheiduimbromid gefärbt. Schließlich wird der Nachweis durch Visualisierung von Banden auf Gelen unter UV-Licht erreicht. Daher werden die Endergebnisse der herkömmlichen PCR nicht als Zahlen ausgedrückt. Normalerweise kann die konventionelle PCR nur einen einzigen Parameter nachweisen.
Was ist Echtzeit-PCR?
Echtzeit-PCR kann die Amplifikation von Produkten nachweisen, während die Produkte synthetisiert werden. Mit der Entwicklung der Technologie ist die PCR zu einer sehr beliebten Technik geworden, insbesondere zum Nachweis und zur Identifizierung von Bakterien in Lebensmitteln. Die Echtzeit-PCR verwendet ein fluoreszierendes Farbstoffsystem und einen Thermocycler, der mit einer Fluoreszenzdetektionsfunktion ausgestattet ist.
Was ist der Unterschied zwischen herkömmlicher PCR und Echtzeit-PCR?
• Herkömmliche PCR ist zeitaufwändiger, da sie Gelelektrophorese verwendet, um die amplifizierten PCR-Produkte zu analysieren. Im Gegensatz dazu ist die Echtzeit-PCR weniger zeitaufwändig, da sie Amplifikationen in den frühen Phasen der Reaktion erkennen kann.
• Echtzeit-PCR sammelt Daten in der exponentiellen Wachstumsphase der PCR, während herkömmliche PCR Daten am Endpunkt der Reaktion sammelt.
• Die Endpunktergebnisse der konventionellen PCR sind möglicherweise nicht sehr genau, aber die Ergebnisse der Echtzeit-PCR sind sehr genau.
• Echtzeit-PCR ist empfindlicher als herkömmliche PCR.
• Herkömmliche PCR hat eine sehr schlechte Auflösung, während Echtzeit-PCR aufgrund der hohen Auflösung nur sehr geringe Veränderungen erkennen kann.
• Die Endpunkterkennung herkömmlicher PCR hat einen kurzen Dynamikbereich, während die Echtzeit-PCR-Erkennung einen großen Dynamikbereich hat.
• Im Gegensatz zur konventionellen PCR finden sich bei der Real-Time-PCR automatisierte Nachweisverfahren.
• Herkömmliche PCR ist hochentwickelt und arbeitsintensiv mehr als Echtzeit-PCR.
• Im Gegensatz zur Echtzeit-PCR kann die herkömmliche PCR nicht zwischen toten und lebenden Bakterien unterscheiden.
• Echtzeit-PCR verwendet ein fluoreszierendes Farbstoffsystem zum Nachweis der Produkte, während herkömmliche PCR Ethidiumbromid und UV-Licht verwendet, um Banden im Agarose-Gelmedium sichtbar zu machen.
