Der Hauptunterschied zwischen herkömmlichen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays besteht darin, dass die herkömmliche PCR eine Technik ist, die entwickelt wurde, um spezifische DNA-Sequenzen zu amplifizieren, und die verschachtelte PCR eine Modifikation der herkömmlichen PCR ist, die aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsreaktionen besteht, obwohl sie echt ist -time PCR ist eine Variante der konventionellen PCR, die das amplifizierte Produkt quantifizieren kann.
PCR ist eine sehr verbreitete wissenschaftliche Technik, die in Forschung und Medizin weit verbreitet ist, um DNA nachzuweisen. PCR-Tests dienen zum Nachweis von Antigenen durch den Nachweis ihrer DNA oder RNA. Im Allgemeinen ist virale RNA im Körper vorhanden, bevor Antikörper nachgewiesen werden oder die Symptome der Krankheit auftreten. Ein PCR-Test kann frühzeitig feststellen, ob jemand das Virus hat oder nicht. Derzeit ist die PCR der Standardtest zum Nachweis der COVID-19-Erkrankung. Es gibt verschiedene Arten von PCR-Techniken wie Real-Time-PCR, Nested-PCR, Multiplex-PCR, Hot-Start-PCR und Long-Range-PCR usw.
Was sind konventionelle PCR-Assays?
Der konventionelle PCR-Assay ist eine In-vitro-DNA-Amplifikationstechnik, die routinemäßig in molekularbiologischen Labors durchgeführt wird. Diese Methode ermöglichte die Herstellung von Tausenden bis Millionen von Kopien eines bestimmten DNA-Fragments. Kary Mullis führte diese Technik 1980 ein. Diese Technik erfordert ein DNA-Fragment, das als Matrize bekannt ist, um viele Kopien davon herzustellen. Taq-Polymerase arbeitet als DNA-Polymerase-Enzym und katalysiert die Synthese neuer Stränge der Template-Sequenz.
Primer in der PCR-Mischung dienen als Ausgangspunkte für die Fragmenterweiterungen. Alle Zutaten, die zur Herstellung von DNA-Kopien erforderlich sind, sind in der PCR-Mischung enth alten. Die PCR-Reaktion wird in einer PCR-Maschine durchgeführt und sollte mit der richtigen PCR-Mischung und dem richtigen PCR-Programm gefüttert werden. Wenn das Reaktionsgemisch und das Programm stimmen, wird es aus einer sehr kleinen Menge DNA die erforderliche Anzahl von Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts herstellen.
Abbildung 01: Konventioneller PCR-Assay
An einer PCR-Reaktion sind drei Hauptschritte beteiligt: Denaturierung, Primer-Annealing und Strangverlängerung. Diese drei Schritte finden bei drei verschiedenen Temperaturen statt. Der PCR-Puffer hält die optimalen Bedingungen für die Wirkung der Taq-Polymerase aufrecht. Diese drei Stufen der PCR-Reaktion werden wiederholt, um die erforderliche Menge des PCR-Produkts herzustellen. Bei jeder PCR-Reaktion verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Kopien. Daher kann bei der PCR eine exponentielle Amplifikation beobachtet werden. Das PCR-Produkt kann mittels Gelelektrophorese aufgelöst werden, da es eine sichtbare Menge an DNA auf einem Gel produziert, und es kann für weitere Studien wie die Sequenzierung gereinigt werden.
PCR ist ein wertvolles Werkzeug in der medizinischen und biologischen Forschung. Besonders in forensischen Studien hat die PCR einen immensen Wert, da sie DNA für Studien aus den winzigen Proben der Kriminellen amplifizieren und forensische DNA-Profile erstellen kann. PCR ist in vielen Bereichen der Molekularbiologie weit verbreitet, einschließlich Genotypisierung, Genklonierung, Mutationserkennung, DNA-Sequenzierung, DNA-Microarrays und Vaterschaftstests.
Was sind verschachtelte PCR-Assays?
Nested PCR ist ein PCR-Typ, der die unspezifische Amplifikation von DNA reduziert. Es gibt zwei aufeinanderfolgende PCRs oder zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsreaktionen im verschachtelten PCR-Assay. Während der ersten Amplifikationsreaktion entsteht ein PCR-Produkt. Nach der ersten Reaktion wird eine zweite Amplifikationsreaktion mit dem PCR-Produkt der ersten Reaktion durchgeführt. Daher binden Primer im zweiten Reaktionsgemisch an das erste PCR-Produkt und amplifizieren es.
Abbildung 02: Verschachtelte PCR
Primerpaare sind in jeder Reaktion unterschiedlich. Die unspezifische Bindung von Primern wird bei der nested PCR reduziert. Nested-PCR-Assays sind nützlich, um die Sensitivität und/oder Spezifität zu erhöhen. Die verschachtelte PCR erfordert jedoch Kenntnisse über die interessierende Sequenz.
Was sind Echtzeit-PCR-Assays?
Echtzeit-PCR oder quantitative PCR (Q-PCR) ist eine modifizierte Version der PCR, die die PCR-Produkte quantitativ misst. Daher quantifiziert diese Technik die Amplifikation in Echtzeit unter Verwendung einer Echtzeit-PCR-Maschine. Es ist auch ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Zielsequenz oder eines Gens, die in einer Probe vorhanden ist.
Das interessante Merkmal der Echtzeit-PCR ist, dass sie sowohl Amplifikation als auch echte Quantifizierung in einem einzigen Schritt kombiniert. Daher kann die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese zum Nachweis durch die Echtzeit-PCR-Technik eliminiert werden. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung von PCR-Produkten während der PCR-Reaktionen wird schließlich zu einer direkten Quantifizierung führen. Wenn die PCR-Produkte akkumuliert werden, werden auch die Fluoreszenzsignale akkumuliert und sie werden von der Echtzeitmaschine gemessen. SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden, um den Amplifikationsprozess der Echtzeit-PCR zu erkennen oder zu beobachten. Beide Methoden überwachen den Fortschritt des Amplifikationsprozesses und melden die Produktmenge in Echtzeit.
Abbildung 03: Real-Time PCR
Real-Time-PCR hat eine Vielzahl von Anwendungen, wie z Erkennung von Infektionserregern.
Was sind die Ähnlichkeiten zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays?
- Verschachtelte und Echtzeit-PCR-Assays sind Modifikationen herkömmlicher PCR-Assays.
- Alle drei Techniken amplifizieren DNA-Proben.
- Ihre Produkte können zur Sequenzierung oder Analyse verwendet werden.
- Diese Tests erfordern Primer.
Was ist der Unterschied zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays?
Konventionelle PCR ist eine Technik, die entwickelt wurde, um spezifische DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Unterdessen ist Nested PCR eine Modifikation der herkömmlichen PCR, die aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsreaktionen besteht, und die Echtzeit-PCR ist eine Variante der herkömmlichen PCR, die in der Lage ist, das amplifizierte Produkt zu quantifizieren. Dies ist also der Hauptunterschied zwischen herkömmlichen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays. Im Gegensatz zur konventionellen und Echtzeit-PCR verwendet die verschachtelte PCR zwei Primer-Sets. Darüber hinaus gibt es bei der nested PCR zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsreaktionen, um die unspezifische Amplifikation zu reduzieren. außerdem enth alten die konventionellen und Echtzeit-PCR-Assays keine zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsreaktionen.
Die folgende Infografik listet die Unterschiede zwischen herkömmlichen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays in tabellarischer Form zum direkten Vergleich auf.
Zusammenfassung – Konventionelle vs. verschachtelte vs. Echtzeit-PCR-Assays
Konventionelle PCR ist die erste Technik, die entwickelt wurde, um spezifische DNA-Fragmente zu amplifizieren. Nested-PCR und Real-Time-PCR sind zwei Varianten der konventionellen PCR. Es gibt zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsreaktionen und die Verwendung von zwei Primersätzen bei der verschachtelten PCR. Echtzeit-PCR wird entwickelt, um das amplifizierte PCR-Produkt zu quantifizieren. Somit fasst dies den Unterschied zwischen herkömmlichen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays zusammen.
