Hauptunterschied – Nick-Übersetzung vs. Primer-Erweiterung
Nick-Translation und Primer-Extension sind zwei wichtige Techniken, die in der Molekularbiologie durchgeführt werden. Der Hauptunterschied zwischen Nick-Translation und Primer-Extension besteht darin, dass der Nick-Translationsprozess markierte Sonden für andere Hybridisierungstechniken produziert, während die Primer-Extension-Methode eine spezifische RNA-Sequenz aus einer Mischung identifiziert und Informationen über die Expression von mRNA preisgibt. Beide Techniken sind von großer Bedeutung und werden routinemäßig in molekularen Forschungslabors durchgeführt.
Was ist Nick-Übersetzung?
Nick-Translation ist eine wichtige Technik zur Herstellung markierter Sonden für verschiedene molekularbiologische Techniken wie Blotting, In-situ-Hybridisierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung etc. Es ist eine In-vitro-Methode zur DNA-Markierung. DNA-Sonden werden verwendet, um spezifische DNA- oder RNA-Sequenzen zu identifizieren. Mit Hilfe einer markierten Sonde können spezifische Fragmente aus einem komplexen Nukleinsäuregemisch markiert oder sichtbar gemacht werden. Daher werden markierte Sonden unter Verwendung verschiedener Techniken hergestellt, um für verschiedene Techniken verwendet zu werden. Die Nick-Translation ist eine solche Methode, die mit Hilfe von DNase 1- und DNA-Polymerase 1-Enzymen markierte Sonden produziert.
Der Nick-Translationsprozess beginnt mit der DNase-1-Enzymaktivität. DNase 1 fügt Nicks in das Phosphatrückgrat doppelsträngiger DNA ein, indem sie Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden sp altet. Sobald der Nick erstellt ist, wird die freie 3'-OH-Gruppe des Nukleotids freigesetzt und das DNA-Polymerase-1-Enzym wirkt darauf ein. Die 5'-zu-3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase 1 entfernt Nukleotide vom Nick in Richtung 3'-Richtung des DNA-Strangs. Gleichzeitig arbeitet die Polymerase-Aktivität des DNA-Polymerase-1-Enzyms und fügt Nukleotide hinzu, um die entfernten Nukleotide zu ersetzen. Wenn die Nukleotide markiert waren, erfolgt der Ersatz durch die markierten Nukleotide und markiert die DNA zur Identifizierung. Diese neu synthetisierte markierte DNA kann als Sonde in verschiedenen Hybridisierungsreaktionen in der Molekularbiologie verwendet werden.
Abbildung 01: Nick-Übersetzungsprozess
Was ist Primer Extension?
Primer Extension ist eine Technik, die verwendet wird, um spezifische RNA-Sequenzen aus einem RNA-Gemisch zu finden und das 5'-Ende des mRNA-Transkripts zu lokalisieren. Es wird auch verwendet, um die Struktur von RNA und die Expression zu untersuchen. Das Primerverlängerungsverfahren wird mit markierten Primern oder mit markierten Nukleotiden durchgeführt. Wenn markierte Primer verwendet werden, schließt dies die Notwendigkeit aus, die Nukleotide zu markieren, die für die Synthese von cDNA verwendet werden. Es gibt mehrere Schritte in dieser Technik. Es beginnt mit der Extraktion von RNA aus der Probe. Dann wird der Mischung ein markierter Oligonukleotid-Primer zusammen mit den notwendigen Bestandteilen zugesetzt, um cDNA einer spezifischen RNA-Sequenz zu synthetisieren. Primer hybridisiert mit der komplementären Sequenz aus der Mischung. Unter Verwendung der Primer-anne alten Sequenz als Matrize synthetisiert das Enzym Reverse Transkriptase die komplementäre DNA (cDNA) der RNA-Sequenz. Primer-Annealing und reverse Transkription finden nur statt, wenn die spezifische RNA-Sequenz in der Probe vorhanden ist. Wenn schließlich eine denaturierende Gelelektrophorese durchgeführt wird, kann die Größe der RNA-Sequenz bestimmt werden. Es ist auch einfach, die +1-Base der mRNA-Sequenz (Transkriptionsinitiationsstelle) durch das Primer-Extension-Verfahren zu finden. Die Menge an in der Probe vorhandener mRNA kann mit dieser Methode quantifiziert werden, wenn überschüssiger Primer verwendet wird.
Abbildung 02: Primerverlängerung
Was ist der Unterschied zwischen Nick Translation und Primer Extension?
Nick-Übersetzung vs. Primer-Erweiterung |
|
| Nick-Translation ist ein Prozess, der markierte DNA-Sonden für verschiedene Hybridisierungsreaktionen erzeugt. | Primer Extension ist eine Technik, die verwendet wird, um spezifische RNA zu finden oder die Genexpression zu untersuchen. |
| Verwendete Enzyme | |
| DNase 1- und DNA-Polymerase-Enzyme werden verwendet. | Reverse-Transkriptase-Enzym wird verwendet. |
| Wichtigkeit | |
| Nick-Translation erleichtert die Markierung spezifischer DNA-Sequenzen. | Primer Extension ermöglicht den Nachweis der spezifischen mRNA-Sequenzgröße und der in der Probe vorhandenen Menge. |
Zusammenfassung – Nick-Übersetzung vs. Primer-Erweiterung
Nick-Translation ist eine Methode zur Synthese markierter Sonden, die auf den Aktivitäten der Enzyme DNase 1 und E. coli-DNA-Polymerase 1 basiert. Es handelt sich um eine In-vitro-Methode, die in den Labors vor verschiedenen Hybridisierungstechniken eingesetzt wird. Während der Nick-Translation entfernt die 5'-3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase 1 Nukleotide vor dem Nick und die Polymerase-Aktivität der DNA-Polymerase 1 ersetzt die entfernten Nukleotide durch markierte Nukleotide hinter dem Nick. Die Primerverlängerung ist eine Methode, die verwendet wird, um ein spezifisches RNA-Transkript aus einem Gemisch nachzuweisen und die Größe und Menge der interessierenden RNA zu quantifizieren. Dies ist der Unterschied zwischen Nick-Translation und Primer-Extension.
