Hauptunterschied – PCR-Primer vs. Sequenzierungsprimer
Mit den jüngsten Entwicklungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie wurden verschiedene genetische Techniken entwickelt, die die Untersuchungsprozesse auf verschiedenen Wegen des Themas einfach und genau machten. PCR und andere Sequenzierungsverfahren sind zwei wichtige derartige Techniken. Sie verwenden unterschiedliche Unterkomponenten. Primer werden als die wichtigste Unterkomponente angesehen, die sowohl PCR- als auch Sequenzierungstechniken gemeinsam ist. PCR-Primer werden zur Amplifikation einer bestimmten DNA-Sequenz verwendet, während Sequenzierungsprimer im Zusammenhang mit der Sequenzierung eines DNA-Fragments mit der Absicht verwendet werden, seine spezifische Reihenfolge der Nukleotidsequenz aufzudecken. Dies ist der Hauptunterschied zwischen PCR-Primern und Sequenzierungsprimern.
Was sind PCR-Primer?
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine genetische Technik, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie verwendet wird, um eine einzelne oder wenige Kopien eines bestimmten DNA-Segments zu amplifizieren und viele Millionen identischer Kopien zu erh alten. In einer PCR-Reaktion werden verschiedene Komponenten einschließlich Primer verwendet. Primer sind kurze DNA-Stränge mit einer Nukleotidlänge von 18-25, wodurch sie mit der Start- und Endregion der zu amplifizierenden DNA-Fragmente kompatibel sind. Primer können ein Forward-Primer und ein Reverse-Primer sein. Diese Primer binden an den spezifischen Punkten an das DNA-Fragment, wo es die DNA-Polymerase dazu bringt, sich an den spezifischen Primer an der Stelle zu binden und die Synthese des neuen DNA-Strangs einzuleiten.
Die Auswahl der Primer ist ein wichtiger Aspekt des PCR-Prozesses. Die Auswahl der Länge des Primers ist wichtig. Die ideale Länge wäre 18-25 Nukleotide. Wenn die Länge zu kurz oder zu lang ist, werden die Primer nicht genau an die zu amplifizierende DNA-Sequenz binden. Zu kurze Primer führen zu unspezifischem Primer-Annealing an unterschiedlichen Stellen der DNA-Sequenz.
Abbildung 01: PCR-Primer
Der Geh alt an Guanin und Cytosin (GC) in einem guten Primer sollte im Bereich von 40-60 liegen. Die Primer-Annealing-Temperatur und Schmelztemperatur sind entscheidende Faktoren während der PCR. Die Schmelztemperatur sollte genau berechnet werden, und die Primer-Annealing-Temperatur sollte 5 0C unter der Schmelztemperatur liegen. Die Schmelztemperatur sollte 60 °C und 75 °C betragen. Zu hohe oder zu niedrige Temperaturen führen zu weniger aktiver DNA-Polymerase-Aktivität.
Was sind Sequenzierungsprimer?
Sequenzierungsprimer werden im Zusammenhang mit der Sequenzierung eines DNA-Fragments mit der Absicht verwendet, seine spezifische Identität aufzudecken. Um gute Sequenzierungsergebnisse zu erzielen, sind qualitativ hochwertige Primer und Templates wichtig. Wenn Primer ausgewählt werden, sollten sie daher für eine bestimmte Region, in der wir sequenzieren möchten, einzigartig sein. Es sollte auch eine korrekte Orientierung haben, wobei die Sequenzen normalerweise vom 3'- bis zum 5'-Ende der Primer generiert werden. Der Sequenz sollte eine unerwünschte Selbsthybridisierung wie die Bildung von Haarnadelschleifen fehlen. Es sollte keine konsekutive Bildung von Guaninbasen enth alten.
Die Schmelztemperatur (Tm) des Primers muss für die Bedingungen der Sequenzierung geeignet sein. Sie sollte also zwischen 52°C und 74°C liegen. Die Herstellung von als Primer zu verwendenden Oligonukleotiden sollte gereinigt werden, um die gewünschte Sequenz in voller Länge zu erh alten. Wenn die Oligonukleotide Verunreinigungen enth alten, wird die Signalgebung der Primersequenz von verschiedenen Priming-Stellen überlagert, und es verringert auch die Anzahl der Basiszellen.
Abbildung 02: Sequenzierungsprimer
Die Primer-Schmelztemperatur (Tm) eines Oligonukleotids bestimmt, wie stark die komplementären DNA-Stränge miteinander hybridisiert werden. Tm kann als thermodynamische Berechnung angesehen werden, wo sie sowohl von DNA-Sequenzen als auch von mehreren Bedingungen wie der Salzkonzentration abhängt. Die Tm ist während der PCR wichtig, wo eine als Zyklussequenzierung bezeichnete Variante verwendet wird, um eine Gruppe von Didesoxynukleotid-terminierten Fragmenten zu produzieren. Dabei wird der sequenzierte Primer zunächst alternativ anneliert, dann verlängert und schließlich zur Amplifikation denaturiert. Daher sollte der Tm-Wert zwischen 52°C und 74°C liegen. Synthetisierte Oligonukleotide können von DNA/RNA-Syntheselabors gemäß Auswahl. Der kleine Synthesemaßstab, der für die DNA-Sequenzierung verwendet wird, beträgt normalerweise 50 nmol. Am wichtigsten ist auch, dass die für die Sequenzierung verwendeten Primer gereinigt werden, damit sie frei von Verunreinigungen sind, die eine Qualitätsminderung verhindern.
Was sind die Ähnlichkeiten zwischen PCR-Primern und Sequenzierungsprimern?
- Sowohl PCR-Primer als auch Sequenzierungs-Primer sind Primer, die im Amplifikationsprozess einer gezielten DNA-Sequenz verwendet werden.
- Sowohl PCR-Primer als auch Sequenzierungs-Primer bestehen aus Nukleotiden.
- Sowohl PCR-Primer als auch Sequenzierungsprimer sind kurze Oligomere.
Was ist der Unterschied zwischen PCR-Primern und Sequenzierungsprimern?
PCR-Primer vs. Sequenzier-Primer |
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| PCR-Primer sind kurze DNA-Stränge mit einer Nukleotidsequenzlänge von 18-25, wodurch sie mit der Start- und Endregion der zu amplifizierenden DNA-Fragmente kompatibel sind. | Sequenzierungsprimer sind kurze Oligomere, die im Zusammenhang mit der Sequenzierung eines DNA-Fragments verwendet werden, um dessen spezifische Identität aufzudecken. |
| Funktion | |
| PCR-Primer werden zur Amplifikation einer bestimmten DNA-Sequenz verwendet. | Sequenzierungsprimer werden im Zusammenhang mit der Sequenzierung eines DNA-Fragments mit der Absicht verwendet, seine spezifische Identität aufzudecken. |
| Anzahl benötigter Primer | |
| Zwei Primer; Als PCR-Primer werden ein Forward-Primer und ein Reverse-Primer verwendet. | Benötigen nur einen Primer als Sequenzierungsprimer. |
Zusammenfassung – PCR-Primer vs. Sequenzierungs-Primer
Sequenzierungsprimer werden im Zusammenhang mit der Sequenzierung eines DNA-Fragments mit der Absicht verwendet, seine spezifische Identität aufzudecken. Ein Sequenzierungsprimer reicht aus, um den Prozess durchzuführen. Um gute Sequenzierungsergebnisse zu erzielen, sind qualitativ hochwertige Primer und Templates wichtig. Wenn Primer ausgewählt werden, sollten sie daher für eine bestimmte Region, in der wir sequenzieren möchten, einzigartig sein. PCR-Primer sind kurze DNA-Stränge mit einer Nukleotidlänge von 18-25, die mit der Start- und Endregion der zu amplifizierenden DNA-Fragmente kompatibel sind. PCR-Primer können ein Vorwärts-Primer und ein Rückwärts-Primer sein. Der Geh alt an Guanin und Cytosin (GC) in einem guten Primer sollte im Bereich von 40-60 liegen. Die Primer-Annealing-Temperatur und Schmelztemperatur sind entscheidende Aspekte während der PCR. Dies ist der Unterschied zwischen PCR-Primern und Sequenzierungsprimern.
