Hauptunterschied – Maxam Gilbert vs. Sanger-Sequenzierung
Nukleotide sind die grundlegenden Struktureinheiten und Bausteine der DNA. Das DNA-Molekül besteht aus einer Polynukleotidkette. In der DNA gibt es vier verschiedene Nukleotide. Diese Nukleotide bestehen aus vier verschiedenen stickstoffh altigen Basen namens A (Adenin), G (Guanin), C (Cytosin), T (Thymin). Die Reihenfolge der Nukleotide im DNA-Molekül ist von großer Bedeutung, da sie eine wichtige genetische Information für das Wachstum und die Entwicklung von Organismen codiert. DNA-Sequenzierung bezieht sich auf den Prozess, der die genaue Nukleotidsequenz der DNA bestimmt. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung und die Sanger-DNA-Sequenzierung sind zwei Methoden der DNA-Sequenzierung, die zur Sequenzierung der ersten Generation gehören. Das Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Basensequenz durch chemische Sp altung der am 5'-Ende markierten DNA-Fragmente vorzugsweise an jedem der vier Nukleotide und Gelelektrophorese. Das Sanger-Sequenzierungsverfahren bestimmt die Nukleotidsequenz durch Synthese einzelsträngiger DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase und Didesoxynukleotiden und Gelelektrophorese. Dies ist der Hauptunterschied zwischen Maxam Gilbert und Sanger Sequencing.
Was ist die Maxam-Gilbert-Sequenzierung?
Maxam-Gilbert-Sequenzierung, auch bekannt als chemische Sequenzierungsmethode, ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA zu bestimmen. Diese Methode wurde 1976 von W alter Gilbert und Alan Maxam eingeführt und wurde populär, da sie direkt mit gereinigter DNA durchgeführt werden kann. Die Maxam-Gilbert-Methode gehört zur ersten Generation der DNA-Sequenzierung und war die erste von Wissenschaftlern weit verbreitete Sequenzierungsmethode.
Das Grundprinzip dieser Methode liegt in der Restriktion der endmarkierten DNA-Fragmente an bestimmten Basen durch basenspezifische Chemikalien und Bedingungen und der Trennung der markierten Fragmente durch Elektrophorese, wie in Abbildung 01 gezeigt. Fragmente werden entsprechend getrennt zu ihren Größen auf dem Gel. Da die Fragmente markiert sind, kann die Sequenz des DNA-Moleküls leicht abgeleitet werden.
Die Maxam-Gilbert-Methode verwendet basenspezifische Chemikalien, um die DNA an bestimmten Basen zu brechen. Zwei gängige Chemikalien namens Dimethylsulfat und Hydrazin-Chemikalien werden verwendet, um Purine bzw. Pyrimidine selektiv anzugreifen.
Die Maxam-Gilbert-Sequenzierungsmethode wird in mehreren Schritten wie folgt durchgeführt.
- Aufreinigung der DNA-Sequenz mit Restriktionsendonucleasen
- Markierung der Enden der DNA-Fragmente durch Zugabe radioaktiver Phosphate
- Reinigung der markierten Fragmente von nicht-markierten Fragmenten durch Gelelektrophorese
- Trennung der endmarkierten DNA in vier Röhrchen und getrennte Behandlung mit basenspezifischen Chemikalien
- Elektrophorese des Inh alts jedes Röhrchens auf separaten Linien auf einem Gel und Trennung der Fragmente entsprechend ihrer Länge.
- Autoradiographischer Nachweis der Fragmente.
Abbildung 01: Maxam-Gilbert-Sequenzierung
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Sanger-Sequenzierung ist eine Sequenzierungsmethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die Basensequenz eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch als Kettenabbruch-Sequenzierungs- oder Dideoxy-Sequenzierungsmethode bekannt. Dieses Verfahren arbeitet nach dem Prinzip des selektiven Einbaus von kettenbeendenden Didesoxynukleotiden (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Synthese von einzelsträngiger DNA, um die Strangbildung zu beenden. Didesoxynukleotiden fehlen 3'-OH-Gruppen für die Bildung von Phosphodiesterbindungen mit benachbarten Nukleotiden. Daher stoppt die Strangbildung, sobald ein ddNTP während der Sanger-Sequenzierung in den sich neu bildenden Strang eingebaut wird.
Bei dieser Methode werden vier separate DNA-Synthesereaktionen (PCR) in vier separaten Röhrchen mit einem ddNTP-Typ durchgeführt. Andere Anforderungen werden auch für die Röhrchen für die PCR bereitgestellt, einschließlich Primer, dNTPs, Taq-Polymerase, spezifische Bedingungen usw. Vier getrennte Reaktionen werden in vier Röhrchen mit vier Mischungen durchgeführt. Nach PCR-Reaktionen werden resultierende DNA-Fragmente hitzedenaturiert und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Dann werden die Fragmente sichtbar gemacht, indem entweder ein markierter (radioaktiver oder fluoreszierender) Primer oder dNTPs verwendet werden, wie in Abbildung 02 gezeigt.
Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Maxam-Gilbert- und Sanger-Sequenzierung?
Maxam Gilbert vs. Sanger Sequenzierung |
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| Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung ist die erste Technik, die für die DNA-Sequenzierung entwickelt wurde. | Die Sanger-Sequenzierungsmethode wurde nach der Maxam-Gilbert-Sequenzierungsmethode eingeführt. |
| Verwendung | |
| Diese Methode wird selten verwendet. | Sanger-Sequenzierung wird routinemäßig zur Sequenzierung verwendet. |
| Verwendung gefährlicher Chemikalien | |
| Es verwendet gefährliche Chemikalien. | Der Einsatz gefährlicher Chemikalien ist im Vergleich zur Maxam-Gilbert-Methode begrenzt. |
| Kennzeichnung zum Nachweis | |
| Diese Methode verwendet radioaktives P32 zur Markierung der Enden der DNA-Fragmente. | Sanger-Sequenzierung verwendet radioaktiv oder fluoreszierend markierte ddNTPs. |
Zusammenfassung – Maxam Gilbert vs. Sanger Sequenzierung
Maxam-Gilbert- und Sanger-Sequenzierung sind zwei Arten von DNA-Sequenzierungstechniken, die unter die DNA-Sequenzierung der ersten Generation fallen. Die Maxam-Gilbert-Sequenzierung ist die erste Methode, die 1976 für die DNA-Sequenzierung eingeführt wurde, und sie wird durchgeführt, indem die am Ende markierten DNA-Fragmente durch basenspezifische Chemikalien aufgebrochen werden. Daher ist es als chemische Sequenzierung bekannt. Die Sanger-Sequenzierungsmethode wurde 1977 eingeführt und basiert auf den ddNTP-gesteuerten Kettenabbruchreaktionen. Die Sanger-Sequenzierungsmethode ist aufgrund mehrerer Nachteile der Maxam-Gilbert-Methode beliebter als die Maxam-Gilbert-Methode, z. B. übermäßiger Zeitaufwand, Verwendung gefährlicher Chemikalien usw. Dies ist der Unterschied zwischen der Sequenzierung nach Maxam Gilbert und Sanger.
