Schlüsselunterschied – Blunt vs. Sticky End Ligation
Restriktionsendonucleasen sind spezifische Enzyme, die doppelsträngige DNA (dsDNA) schneiden. Sie werden in der Molekularbiologie auch als Molekularschere bezeichnet. Restriktionsenzyme sind in der Lage, bestimmte kurze Sequenzen der dsDNA, sogenannte Erkennungsstellen, zu erkennen und Phosphodiester- und Wasserstoffbrückenbindungen zu offenen Doppelsträngen zu sp alten. Als Ergebnis der Sp altung durch diese Enzyme werden DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Arten von Enden wie klebrigen Enden und stumpfen Enden produziert. DNA-Ligase ist ein Enzym, das in der Molekularbiologie verwendet wird, um zwei benachbarte DNA-Stränge durch Bildung neuer Bindungen zu verbinden. Der Schritt ist als Ligation bekannt und kann je nach Art des ligierten DNA-Endes als Ligation mit stumpfen Enden und Ligation mit klebrigen Enden bezeichnet werden. Der Hauptunterschied zwischen stumpfer und klebriger Endligation besteht darin, dass die stumpfe Endligation zwischen DNA-Fragmenten erfolgt, die zwei stumpfe Enden enth alten, während die klebrige Endligation zwischen 5'- und 3'-Überhängen auftritt. Im Vergleich zur stumpfen Endligatur ist die klebrige Endligatur effizienter und stabiler.
Was ist eine Blunt End Ligation?
Einige Restriktionsendonucleasen können die DNA an den gegenüberliegenden Basen schneiden und DNA-Fragmente mit stumpfen Enden erzeugen. Diese Enzyme sind als stumpfe Endschneider bekannt; sie sp alten direkt bis zur Mitte der Restriktionsstelle, ohne einzelsträngige überhängende Basen zu hinterlassen. Stumpfe Enden werden auch als nicht überhängende Enden bezeichnet, da sie an den Enden keine 3 'und 5' überhängenden Basen haben. Beide Stränge enden an Basenpaaren in stumpfen Enden. Übliche Blunt-End-Cutting-Enzyme sind EcoRV HaeIII, AluI und SmaI.
Blunt End Ligation ist zwischen zwei stumpfen Enden beteiligt. Es handelt sich nicht um eine Ligation vorstehender Basen. Diese Ligation ist weniger effizient als die Ligation am klebrigen Ende. In manchen Fällen ist die Ligation mit stumpfen Enden jedoch vorteilhafter als die Ligation mit klebrigen Enden, insbesondere wenn PCR-Produkte ligiert werden. PCR-Produkte werden immer mit stumpfen Enden hergestellt. Die Ligation stumpfer Enden erfordert keine komplementären Enden in der DNA für die Ligation.
Abbildung 01: Produktion stumpfer Enden durch das Eco-RV-Enzym
Was ist eine Sticky-End-Ligation?
Einige Restriktionsendonucleasen sind in der Lage, dsDNA zu schneiden, wobei am Ende ein überhängendes Stück einzelsträngiger DNA zurückbleibt. Diese Enden sind als klebrige oder überhängende Enden bekannt. Die Ligation klebriger Enden tritt zwischen zwei DNA-Fragmenten auf, die passende Überhänge enth alten, da klebrige Enden mit ungepaarten Basen besessen sind und komplementäre Basen erfordern, um Bindungen zu bilden. Daher ist es notwendig, dasselbe Restriktionsenzym für beide DNA-Quellen zu verwenden, um die passenden Ligationsfragmente herzustellen.
Sticky-End-Ligation ist effizienter und bei Klonierungsprozessen oft sehr wünschenswert. Es gibt mehrere Restriktionsenzyme, die klebrige Enden erzeugen. Sie sind EcoRI, BamHI, HindIII usw.
Abbildung 02: Produktion klebriger Enden durch das Eco RI-Enzym
Was ist der Unterschied zwischen Blunt- und Sticky-End-Ligation?
Blunt vs. Sticky End Ligation |
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| Ligation mit stumpfen Enden tritt zwischen zwei DNA-Fragmenten mit stumpfen Enden auf. | Ligierung von klebrigen Enden tritt zwischen zwei übereinstimmenden DNA-Fragmenten mit klebrigen Enden auf. |
| Enzyme | |
| Stumpfschneider erzeugen stumpfe Enden. | Klebrige Endenschneider erzeugen klebrige oder kohäsive Enden. |
| Anforderung passender Enden | |
| Es sind keine passenden Fragmente oder komplementären Basen erforderlich. | Es erfordert komplementäre Basen an den Enden, um Basenpaare zu bilden. |
| Effizienz | |
| Es ist weniger effizient als die klebrige Endligatur | Es ist effizienter als eine stumpfe Endligatur. |
Zusammenfassung – Blunt vs. Sticky End Ligation
Restriktionsendonucleasen sind in der Lage, dsDNA zu sp alten und DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Enden zu produzieren. Sie erkennen spezifische Sequenzen und schränken die DNA ein, wodurch klebrige und stumpfe Enden entstehen. Klebrige Enden haben ungepaarte Basen am Ende der Fragmente. Stumpfe Enden entstehen aufgrund einer geraden Sp altung und sie haben Basenpaare an den Enden. Die klebrige Endligation erfordert zwei komplementäre einzelsträngige DNA-Stücke. Die Ligation stumpfer Enden tritt zwischen zwei beliebigen Fragmenten mit stumpfen Enden auf. Dies ist der Unterschied zwischen stumpfer und klebriger Ligation.
