Hauptunterschied – Microarray vs. RNA-Sequenzierung
Transkriptom stellt den gesamten Inh alt der RNA dar, die in einer Zelle vorhanden ist, einschließlich mRNA, rRNA, tRNA, abgebauter RNA und nicht abgebauter RNA. Das Transkriptom-Profiling ist ein wichtiger Prozess, um die Zelleinblicke zu verstehen. Es gibt mehrere fortschrittliche Methoden zur Erstellung von Transkriptomprofilen. Microarray und RNA-Sequenzierung sind zwei Arten von Technologien, die zur Analyse des Transkriptoms entwickelt wurden. Der Hauptunterschied zwischen Microarray- und RNA-Sequenzierung besteht darin, dass Microarray auf dem Hybridisierungspotenzial von vorgefertigten markierten Sonden mit Ziel-cDNA-Sequenzen basiert, während RNA-Sequenzierung auf der direkten Sequenzierung von cDNA-Strängen durch fortschrittliche Sequenzierungstechniken wie NGS basiert. Microarray wird mit Vorkenntnissen über die Sequenzen durchgeführt und RNA-Sequenzierung wird ohne Vorkenntnisse über Sequenzen durchgeführt.
Was ist Microarray?
Microarray ist eine robuste, zuverlässige Methode mit hohem Durchsatz, die von Wissenschaftlern zur Erstellung von Transkriptomprofilen verwendet wird. Es ist der beliebteste Ansatz für die Transkriptanalyse. Es ist eine kostengünstige Methode, die von den Hybridisierungssonden abhängt.
Die Technik beginnt mit der Extraktion von mRNA aus der Probe und dem Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA. Dann wird es mit fluoreszenzmarkierten vorgefertigten Sonden auf einer festen Oberfläche (Spot-Matrix) gemischt. Komplementäre Sequenzen hybridisieren mit den markierten Sonden im Microarray. Dann wird der Mikroarray gewaschen und gescreent, und das Bild wird quantifiziert. Die gesammelten Daten sollten analysiert werden, um die relativen Expressionsprofile zu erh alten.
Es wird angenommen, dass die Intensität der Mikroarray-Sonden proportional zur Menge der Transkripte in der Probe ist. Die Genauigkeit der Technik hängt jedoch von den entworfenen Sonden, der vorherigen Kenntnis der Sequenz und der Affinität der Sonden für die Hybridisierung ab. Daher hat die Microarray-Technologie Einschränkungen. Die Microarray-Technik kann nicht mit Transkripten in geringer Menge durchgeführt werden. Es kann Isoformen nicht unterscheiden und genetische Varianten identifizieren. Da dieses Verfahren von der Hybridisierung von Sonden abhängt, treten bei der Microarray-Technik einige Probleme im Zusammenhang mit der Hybridisierung wie Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung usw. auf.
Abbildung 01: Microarray
Was ist RNA-Sequenzierung?
RNA-Shotgun-Sequenzierung (RNA seq) ist eine kürzlich entwickelte Technik zur Sequenzierung des gesamten Transkriptoms. Es ist eine schnelle Methode mit hohem Durchsatz zur Erstellung von Transkriptomprofilen. Es quantifiziert direkt die Expression von Genen und führt zu einer gründlichen Untersuchung des Transkriptoms. RNA seq hängt nicht von vorgefertigten Sonden oder Vorkenntnissen der Sequenzen ab. Daher hat die RNA-Seq-Methode eine hohe Empfindlichkeit und Fähigkeit, neue Gene und genetische Varianten zu erkennen.
RNA-Sequenzierungsmethode wird in mehreren Schritten durchgeführt. Die gesamte RNA der Zelle muss isoliert und fragmentiert werden. Dann muss unter Verwendung von reverser Transkriptase eine cDNA-Bibliothek hergestellt werden. Jeder cDNA-Strang muss mit Adaptern ligiert werden. Dann müssen die ligierten Fragmente amplifiziert und gereinigt werden. Abschließend muss mit einer NGS-Methode eine Sequenzierung der cDNA durchgeführt werden.
Abbildung 02: RNA-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Microarray- und RNA-Sequenzierung?
Mikroarray vs. RNA-Sequenzierung |
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| Microarray ist eine robuste, zuverlässige Methode mit hohem Durchsatz. | RNA-Sequenzierung ist eine genaue Methode mit hohem Durchsatz. |
| Kosten | |
| Dies ist eine kostengünstige Methode. | Dies ist eine teure Methode. |
| Analyse einer großen Anzahl von Proben | |
| Dies erleichtert die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Proben. | Dies erleichtert die Analyse einer großen Anzahl von Proben. |
| Datenanalyse | |
| Datenanalyse ist komplex. | Bei dieser Methode werden mehr Daten generiert; daher ist der Prozess komplexer. |
| Vorkenntnisse über Sequenzen | |
| Diese Methode basiert auf Hybridisierungssonden, daher sind Vorkenntnisse der Sequenzen erforderlich. | Diese Methode ist unabhängig von Vorkenntnissen über Sequenzen. |
| Strukturelle Variationen und neuartige Gene | |
| Diese Methode kann strukturelle Variationen und neue Gene nicht erkennen. | Diese Methode kann strukturelle Variationen wie Genfusion, alternatives Spleißen und neue Gene erkennen. |
| Empfindlichkeit | |
| Dies kann keine Unterschiede in der Expression von Isoformen erkennen, daher ist die Empfindlichkeit begrenzt. | Dies hat eine hohe Empfindlichkeit. |
| Ergebnis | |
| Dies kann nur zu relativen Expressionsniveaus führen. Dies gibt keine absolute Quantifizierung der Genexpression. | Es gibt absolute und relative Expressionsniveaus. |
| Daten-Reanalyse | |
| Dies muss für eine erneute Analyse erneut ausgeführt werden. | Sequenzdaten können erneut analysiert werden. |
| Bedarf an spezifischem Personal und Infrastruktur | |
| Für Mikroarrays sind keine spezielle Infrastruktur und kein spezielles Personal erforderlich. | Spezielle Infrastruktur und Personal, die für die RNA-Sequenzierung erforderlich sind. |
| Technische Probleme | |
| Die Microarray-Technik hat technische Probleme wie Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung, begrenzte Nachweisrate einzelner Sonden usw. | Die RNA-Seq-Technik vermeidet technische Probleme wie Kreuzhybridisierung, unspezifische Hybridisierung, begrenzte Erkennungsrate einzelner Sonden usw. |
| Vorurteile | |
| Dies ist eine voreingenommene Methode, da sie von der Hybridisierung abhängt. | Bias ist im Vergleich zu Microarray gering. |
Zusammenfassung – Microarray vs. RNA-Sequenzierung
Microarray- und RNA-Sequenzierungsmethoden sind Plattformen mit hohem Durchsatz, die für das Transkriptom-Profiling entwickelt wurden. Beide Methoden liefern Ergebnisse, die stark mit Genexpressionsprofilen korrelieren. Die RNA-Sequenzierung hat jedoch Vorteile gegenüber Mikroarrays für die Genexpressionsanalyse. Die RNA-Sequenzierung ist eine empfindlichere Methode zum Nachweis von Transkripten in geringer Häufigkeit als Microarray. Die RNA-Sequenzierung ermöglicht auch die Differenzierung zwischen Isoformen und die Identifizierung von Genvarianten. Microarray ist jedoch die gemeinsame Wahl der meisten Forscher, da die RNA-Sequenzierung eine neue und teure Technik mit Herausforderungen bei der Datenspeicherung und komplexen Datenanalyse ist.
