Hauptunterschied – NGS vs. Sanger-Sequenzierung
Next Generation Sequencing (NGS) und Sanger Sequencing sind zwei Arten von Nukleotidsequenzierungstechniken, die im Laufe der Zeit entwickelt wurden. Die Sanger-Sequenzierungsmethode war viele Jahre lang weit verbreitet und wurde kürzlich aufgrund ihrer Vorteile durch NGS ersetzt. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass NGS nach dem Prinzip der gleichzeitigen schnellen Sequenzierung von Millionen von Sequenzen durch ein Sequenzierungssystem arbeitet, während die Sanger-Sequenzierung nach dem Prinzip des Kettenabbruchs aufgrund des selektiven Einbaus von Didesoxynukleotiden durch das DNA-Polymerase-Enzym arbeitet während der DNA-Replikation und der daraus resultierenden Fragmenttrennung durch Kapillarelektrophorese.
Was ist Nukleotidsequenzierung?
Genetische Informationen sind in den Nukleotidsequenzen der DNA oder RNA eines Organismus gespeichert. Der Prozess der Bestimmung der korrekten Reihenfolge von Nukleotiden (unter Verwendung von vier Basen) in einem bestimmten Fragment (in einem Gen, Gencluster, Chromosom und vollständigen Genom) wird als Nukleotidsequenzierung bezeichnet. Es ist sehr wichtig in genomischen Studien, forensischen Studien, Virologie, biologischer Systematik, medizinischer Diagnose, Biotechnologie und in vielen anderen Bereichen, die Struktur und Funktion von Genen zu analysieren. Es gibt verschiedene Arten von Sequenzierungsmethoden, die von Wissenschaftlern entwickelt wurden. Unter ihnen war die 1977 von Frederick Sanger entwickelte Sanger-Sequenzierung lange Zeit weit verbreitet und populär, bis Next Generation Sequencing sie ersetzte.
Was ist NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) ist ein Begriff für moderne Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien, die Genomstudien und Molekularbiologie revolutioniert haben. Diese Techniken sind Illumina-Sequenzierung, Roche 454-Sequenzierung, Ion-Proton-Sequenzierung und SOLiD-Sequenzierung (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-Systeme sind schneller und billiger. Vier Haupt-DNA-Sequenzierungsmethoden werden in NGS-Systemen verwendet, nämlich; Pyrosequenzierung, Sequenzierung durch Synthese, Sequenzierung durch Ligation und Ionenhalbleitersequenzierung. Eine große Anzahl von DNA- oder RNA-Strängen (Millionen) kann parallel sequenziert werden. Es ermöglicht die Sequenzierung des gesamten Genoms von Organismen innerhalb kurzer Zeit, im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung, die mehr Zeit in Anspruch nimmt.
NGS hat viele Vorteile gegenüber der konventionellen Sanger-Sequenzierungsmethode. Es handelt sich um ein schnelles, genaueres und kostengünstigeres Verfahren, das mit einer kleinen Probengröße durchgeführt werden kann. NGS kann in metagenomischen Studien, beim Nachweis von Variationen innerhalb eines individuellen Genoms aufgrund von Insertionen und Deletionen usw. und bei der Analyse von Genexpressionen verwendet werden.
Abbildung_1: Entwicklungen in der NGS-Sequenzierung
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Sanger-Sequenzierung ist eine Sequenzierungsmethode, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde, um die genaue Nukleotidreihenfolge eines bestimmten DNA-Fragments zu bestimmen. Es ist auch als Kettenabbruchsequenzierung oder Didesoxy-Sequenzierung bekannt. Das Arbeitsprinzip dieses Verfahrens ist die Terminierung der Strangsynthese durch selektiven Einbau eines kettenterminierenden Didesoxynukleotids (ddNTPs) wie ddGTP, ddCTP, ddATP und ddTTP durch DNA-Polymerase während der Replikation von DNA. Normale Nukleotide haben 3'-OH-Gruppen für die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten Nukleotiden, um die Strangbildung fortzusetzen. ddNTPs fehlt jedoch diese 3'-OH-Gruppe und sie sind nicht in der Lage, Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleotiden zu bilden. Damit ist die Kettenverlängerung beendet.
Bei diesem Verfahren dient die zu sequenzierende einzelsträngige DNA als Template-Strang für die in vitro DNA-Synthese. Andere Anforderungen sind Oligonukleotid-Primer, Desoxynukleotid-Vorläufer und DNA-Polymerase-Enzym. Wenn die flankierenden Enden des Zielfragments bekannt sind, können Primer leicht für die DNA-Replikation entworfen werden. Vier separate DNA-Synthesereaktionen werden in vier separaten Röhrchen durchgeführt. Jede Röhre hat separate ddNTPs, zusammen mit anderen Anforderungen. Aus dem jeweiligen Nukleotid wird eine Mischung aus dNTPs und ddNTPs hinzugefügt. Ebenso werden vier getrennte Reaktionen in vier Röhrchen mit vier Mischungen durchgeführt. Nach den Reaktionen erfolgt der Nachweis von DNA-Fragmenten und die Umwandlung des Fragmentmusters in Sequenzinformationen. Die resultierenden DNA-Fragmente werden hitzedenaturiert und durch Gelelektrophorese aufgetrennt. Wenn radioaktive Nukleotide verwendet werden, kann das Bandenmuster im Polyacrylamidgel durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Wenn dieses Verfahren die fluoreszierend markierten Didesoxynukleotide verwendet, können sie entlang des Gels abgeschwächt und durch einen Laserstrahl geleitet werden, um von dem Fluoreszenzdetektor nachgewiesen zu werden. Um Fehler zu vermeiden, die auftreten könnten, wenn eine Sequenz mit dem Auge gelesen und manuell in einen Computer eingegeben wird, entwickelte sich diese Methode zur Verwendung eines automatisierten Sequenzers, der mit dem Computer gekoppelt ist.
Dies ist die Methode, die verwendet wird, um DNA aus dem Humangenomprojekt zu sequenzieren. Diese Methode wird immer noch mit fortgeschrittenen Modifikationen verwendet, da sie trotz eines teuren und langsamen Prozesses genaue Sequenzinformationen liefert.
Figure_2: Sanger-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung?
NGS vs. Sanger-Sequenzierung |
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| Next Generation Sequencing (NGS) bezeichnet moderne Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren. Es beschreibt eine Reihe verschiedener moderner Sequenzierungstechnologien | Sanger-Sequenzierung ist eine von Frederick Sanger entwickelte Sequenzierungsmethode zur Bestimmung der genauen Nukleotidreihenfolge eines bestimmten DNA-Fragments. |
| Kosteneffizienz | |
| NGS ist ein billigeres Verfahren, da es Zeit, Arbeitskraft und Chemikalien reduziert. | Dies ist ein kostspieliger Prozess, da er Zeit, Arbeitskraft und mehr Chemikalien erfordert. |
| Geschwindigkeit | |
| Dies ist schneller, da sowohl der chemische Nachweis als auch der Signalnachweis vieler Stränge parallel erfolgen. | Dies ist zeitaufwändig, da der chemische Nachweis und der Signalnachweis als zwei getrennte Prozesse erfolgen und nur ein Strang gleichzeitig lesen kann. |
| Zuverlässigkeit | |
| NGS ist zuverlässig. | Sanger-Sequenzierung ist weniger zuverlässig |
| Stichprobe | |
| NGS benötigt weniger DNA. | Diese Methode benötigt eine große Menge Template-DNA. |
| DNA-Basen pro sequenziertem Fragment | |
| Die Anzahl der DNA-Basen pro sequenziertem Fragment ist geringer als bei der Sanger-Methode | Generierende Sequenzen sind länger als NGS-Sequenzen. |
Zusammenfassung – NGS vs. Sanger-Sequenzierung
NGS und Sanger-Sequenzierung sind Nukleotidsequenzierungstechniken, die in der Molekularbiologie weit verbreitet sind. Die Sanger-Sequenzierung ist eine frühe Sequenzierungsmethode, die durch NGS ersetzt wurde. Der Hauptunterschied zwischen NGS und Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass NGS ein schneller, genauerer und kostengünstigerer Prozess ist als die Sanger-Sequenzierung. Beide Techniken führten zu großen Ausbrüchen in der Genetik und Biotechnologie.
