Hauptunterschied – PCR vs. DNA-Sequenzierung
PCR und DNA-Sequenzierung sind zwei wichtige Techniken in der Molekularbiologie. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist der Prozess, der eine große Anzahl von Kopien eines DNA-Fragments erstellt. Die DNA-Sequenzierung ist die Technik, die zu einer genauen Reihenfolge der Nukleotide eines gegebenen DNA-Fragments führt. Dies ist der Hauptunterschied zwischen PCR- und DNA-Sequenzierung. Die PCR ist einer der wichtigsten Schritte bei der DNA-Sequenzierung.
Was ist PCR?
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine DNA-Amplifikationstechnik, die in der Molekularbiologie verwendet wird. Es produziert Tausende bis Millionen Kopien eines bestimmten DNA-Fragments. Dieses Verfahren wurde 1983 von Kary Mullis entwickelt. Bei dieser Technik dient das zu amplifizierende DNA-Fragment als Matrize und das DNA-Polymerase-Enzym fügt komplementäre Nukleotide zu dem Primer hinzu, der in der PCR-Mischung verfügbar ist. Am Ende der PCR-Reaktion werden viele Kopien der Proben-DNA synthetisiert.
Es gibt verschiedene Komponenten der PCR-Mischung, darunter DNA, DNA-Polymerase (Taq-Polymerase), Primer (Vorwärts- und Rückwärts-Primer), Nukleotide (Bausteine der DNA) und einen Puffer. Die PCR findet in einer PCR-Maschine statt, und die richtige PCR-Mischung sollte in die Maschine geladen werden, und das richtige Programm sollte angesteuert werden. Diese Technik ermöglicht die Herstellung von Tausenden bis Millionen von Kopien eines bestimmten DNA-Abschnitts aus einer sehr kleinen DNA-Menge.
PCR-Reaktionen finden zyklisch statt, um die sichtbare Menge an PCR-Produkten auf einem Gel zu erzeugen. An einer PCR-Reaktion sind drei Hauptschritte beteiligt, nämlich Denaturierung, Primer-Annealing und Strangverlängerung, wie in Abbildung 01 gezeigt. Diese drei Schritte finden bei drei verschiedenen Temperaturen statt. DNA existiert in doppelsträngiger Form durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen. Vor der Implikation sollte doppelsträngige DNA voneinander getrennt werden. Dies geschieht durch eine hohe Temperatur. Bei hoher Temperatur denaturiert doppelsträngige DNA in Einzelstränge. Dann sollten die Primer näher an die flankierenden Enden des spezifischen Fragments oder des Gens der DNA herankommen. Primer ist ein kurzes Stück einzelsträngiger DNA, das komplementär zur Zielsequenz ist. Forward- und Reverse-Primer annealen mit den komplementären Basen an den flankierenden Enden der denaturierten Proben-DNA bei der Annealing-Temperatur. Grundierungen sollten hitzebeständig sein. Sobald die Primer mit Proben-DNA hybridisieren, initiiert das Taq-Polymerase-Enzym die Synthese der neuen Stränge, indem es Nukleotide hinzufügt, die zur Ziel-DNA komplementär sind. Taq-Polymerase ist ein hitzestabiles Enzym, das aus einem thermophilen Bakterium namens Thermus aquaticus isoliert wurde. Der PCR-Puffer hält die optimalen Bedingungen für die Wirkung der Taq-Polymerase aufrecht. Diese drei Stufen der PCR-Reaktionen werden wiederholt, um die erforderliche Menge an PCR-Produkt herzustellen. Nach jeder PCR-Reaktion wird die Anzahl der DNA-Kopien verdoppelt. Daher kann bei der PCR eine exponentielle Amplifikation beobachtet werden. PCR-Produkte können mittels Gelelektrophorese beobachtet und für weitere Untersuchungen aufgereinigt werden.
Abbildung 01: Hauptschritte einer PCR-Reaktion
PCR ist ein wertvolles Werkzeug in der medizinischen und biologischen Forschung. PCR hat einen besonderen Wert in der forensischen Wissenschaft, da sie DNA für Studien aus den winzigen Proben der Kriminellen amplifizieren und forensische DNA-Profile erstellen kann. PCR ist in vielen Bereichen der Molekularbiologie weit verbreitet, einschließlich Genotypisierung, Genklonierung, Mutationserkennung, DNA-Sequenzierung, DNA-Mikroarrays und Vaterschaftstests usw.
Abbildung 02: Polymerase-Kettenreaktion
Was ist DNA-Sequenzierung?
DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung einer genauen Reihenfolge der Nukleotide – Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin in einem bestimmten DNA-Fragment. Die genetische Information wird in den DNA-Sequenzen unter Verwendung der richtigen Reihenfolge der Nukleotide gespeichert. Daher ist es sehr wichtig, die genaue Reihenfolge der Nukleotide in einem DNA-Fragment zu finden, um die Struktur und Funktion der Gene zu kennen.
Das DNA-Sequenzierungsprotokoll umfasst verschiedene Prozesse. Der erste Schritt ist die Isolierung interessierter DNA oder genomischer DNA eines Organismus. Mittels PCR (wie oben beschrieben) sollte die gewünschte Region der DNA amplifiziert werden. Amplifiziertes PCR-Produkt sollte gelelektrophoretisch aufgetrennt und gereinigt werden. Amplifizierte Fragmente dienen als Template für die Sequenzierung. Die Sequenzierung kann entweder nach der Sanger-Sequenzierung oder nach dem Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren erfolgen. Die Sanger-Sequenzierung erfordert eine Kapillarelektrophorese der resultierenden DNA-Fragmente. Die Bestimmung der korrekten Nukleotidreihenfolge kann durch manuelles Lesen von Autoradiogrammen oder mit automatisierten DNA-Sequenziergeräten erfolgen.
Die Gensequenzierung trug zum Humangenomprojekt bei und erleichterte 2003 die Kartierung des menschlichen Genoms. In der Forensik ermöglichte die DNA-Sequenzierung die Identifizierung von Personen, die einzigartige DNA-Sequenzen aufweisen, und identifizierte die Kriminellen. In der Medizin kann die DNA-Sequenzierung verwendet werden, um die für genetische und andere Krankheiten verantwortlichen Gene zu erkennen, defekte Gene zu finden und sie durch korrekte Gene zu ersetzen. In der Landwirtschaft werden DNA-Sequenzierungsinformationen einiger Mikroorganismen verwendet, um transgene Nutzpflanzen mit wirtschaftlich erwünschten Eigenschaften zu produzieren.
Abbildung 03: DNA-Sequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen PCR und DNA-Sequenzierung?
PCR vs. DNA-Sequenzierung |
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| Der PCR-Prozess erzeugt Tausende bis Millionen Kopien des interessierenden DNA-Fragments. | DNA-Sequenzierung ist der Prozess der Bestimmung der genauen Reihenfolge der Nukleotide in einem bestimmten DNA-Fragment. |
| Ergebnis | |
| PCR erzeugt Tausende bis Millionen Kopien eines bestimmten DNA-Fragments | Dies ergibt die richtige Reihenfolge der Basen in einem bestimmten DNA-Fragment. |
| Beteiligung von ddNTPs | |
| PCR erfordert keine ddNTPs. Es verwendet dNTPs. | Die DNA-Sequenzierung erfordert ddNTPs, um die Strangbildung zu beenden. |
Zusammenfassung – PCR vs. DNA-Sequenzierung
PCR und DNA-Sequenzierung sind sehr wichtige Werkzeuge in vielen Bereichen der Molekularbiologie. Die Amplifikation der DNA-Fragmente erfolgt durch die PCR-Technik, während die korrekte Reihenfolge der Nukleotide eines DNA-Fragments durch die DNA-Sequenzierung bestimmt wird. Dies ist der Unterschied zwischen PCR und DNA-Sequenzierung.
