Hauptunterschied – Sanger-Sequenzierung vs. Pyrosequenzierung
Die DNA-Sequenzierung ist sehr wichtig für die DNA-Analyse, da die Kenntnis der korrekten Anordnung der Nukleotide auf einer bestimmten DNA-Region viele wichtige Informationen darüber preisgibt. Es gibt verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden. Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden, die in der Molekularbiologie weit verbreitet sind. Der Hauptunterschied zwischen der Sanger-Sequenzierung und der Pyrosequenzierung besteht darin, dass die Sanger-Sequenzierung Didesoxynukleotide verwendet, um die DNA-Synthese zum Lesen der Nukleotidsequenz zu beenden, während die Pyrosequenzierung die Pyrophosphatfreisetzung erkennt, indem die Nukleotide eingebaut und die komplementäre Sequenz synthetisiert werden, um die genaue Reihenfolge der Sequenz zu lesen.
Was ist Sanger-Sequenzierung?
Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode der ersten Generation, die 1977 von Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt wurde. Sie ist auch als Kettenterminierungssequenzierung oder Dideoxy-Sequenzierung bekannt, da sie auf Kettenterminierung durch Didesoxynukleotide (ddNTPs) basiert. Diese Methode war mehr als 30 Jahre lang weit verbreitet, bis das New Generation Sequencing (NGS) entwickelt wurde. Die Sanger-Sequenzierungstechnik ermöglichte die Entdeckung der richtigen Nukleotidreihenfolge oder die Anheftung eines bestimmten DNA-Fragments. Es basiert auf dem selektiven Einbau von ddNTPs und der Beendigung der DNA-Synthese während der in-vitro-DNA-Replikation. Das Fehlen von 3'-OH-Gruppen zur Fortsetzung der Phosphodiesterbindungsbildung zwischen benachbarten Nukleotiden ist ein einzigartiges Merkmal von ddNTPs. Daher hört die Kettenverlängerung auf und endet von diesem Punkt an, sobald das ddNTP angebracht ist. Es gibt vier ddNTPs – ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP – die bei der Sanger-Sequenzierung verwendet werden. Diese Nukleotide stoppen den DNA-Replikationsprozess, wenn sie in den wachsenden DNA-Strang eingebaut werden und zu unterschiedlich langen kurzen DNA führen. Kapillargelelektrophorese wird verwendet, um diese kurzen DNA-Stränge nach ihrer Größe auf einem Gel zu organisieren, wie in Abbildung 01 gezeigt.
Abbildung 1: Kapillargelelektrophorese synthetisierter kurzer DNA
Für die In-vitro-Replikation von DNA sollten nur wenige Anforderungen erfüllt werden. Sie sind DNA-Polymerase-Enzym, Matrizen-DNA, Oligonukleotid-Primer und Desoxynukleotide (dNTPs). Bei der Sanger-Sequenzierung wird die DNA-Replikation in vier separaten Reagenzgläsern zusammen mit vier Arten von ddNTPs separat durchgeführt. Desoxynukleotide werden nicht vollständig durch die entsprechenden ddNTPs ersetzt. Eine Mischung des jeweiligen dNTP (zum Beispiel dATP + ddATP) wird in das Röhrchen eingeschlossen und repliziert. Vier getrennte Röhrchenprodukte werden auf einem Gel in vier getrennten Vertiefungen laufen gelassen. Durch Lesen des Gels kann dann die Sequenz wie in Abbildung 02 gezeigt konstruiert werden.
Abbildung 02: Sanger-Sequenzierung
Sanger-Sequenzierung ist eine wichtige Technik, die in vielen Bereichen der Molekularbiologie hilfreich ist. Humangenomprojekt erfolgreich mit Hilfe von Sanger-Sequenzierungs-basierten Methoden abgeschlossen. Die Sanger-Sequenzierung ist auch nützlich bei der Ziel-DNA-Sequenzierung, der Krebs- und genetischen Krankheitsforschung, der Genexpressionsanalyse, der Identifizierung von Menschen, dem Nachweis von Krankheitserregern, der mikrobiellen Sequenzierung usw.
Die Sanger-Sequenzierung hat mehrere Nachteile:
- Die Länge der zu sequenzierenden DNA darf 1000 Basenpaare nicht überschreiten
- Es kann immer nur ein Strang sequenziert werden.
- Der Prozess ist zeitaufwändig und teuer.
Daher wurden im Laufe der Zeit neue fortschrittliche Sequenzierungstechniken entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die Sanger-Sequenzierung wird jedoch aufgrund ihrer hochgenauen Ergebnisse für Fragmente mit einer Länge von bis zu etwa 850 Basenpaaren immer noch verwendet.
Was ist Pyrosequenzierung?
Pyrosequencing ist eine neuartige DNA-Sequenzierungstechnik, die auf der „Sequenzierung durch Synthese“basiert. Diese Technik beruht auf dem Nachweis der Pyrophosphatfreisetzung nach dem Nukleotideinbau. Der Prozess wird von vier verschiedenen Enzymen verwendet: DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase und zwei Substraten, Adenosin-5'-Phosphosulfat (APS) und Luciferin.
Der Prozess beginnt mit der Bindung des Primers an die einzelsträngige DNA-Matrize und die DNA-Polymerase beginnt mit dem Einbau der dazu komplementären Nukleotide. Wenn sich die Nukleotide verbinden (Nukleinsäurepolymerisation), werden Pyrophosphatgruppen (zwei miteinander verbundene Phosphatgruppen) und Energie freigesetzt. Jede Nukleotidaddition setzt eine äquimolare Menge Pyrophosphat frei. Pyrophosphat wird in Gegenwart des Substrats APS durch ATP-Sulfurylase in ATP umgewandelt. Das erzeugte ATP treibt die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luciferin in Oxyluciferin voran, wodurch sichtbares Licht in Mengen erzeugt wird, die proportional zur Menge an ATPs sind. Licht wird von einem Photonendetektor oder einem Photomultiplier erfasst und erzeugt ein Pyrogramm. Apyrase baut ATP und nicht eingebaute dNTPs im Reaktionsgemisch ab. Die dNTP-Zugabe erfolgt jeweils einmal. Da die Anlagerung von Nukleotiden nach Einbau und Detektion von Licht bekannt ist, kann die Sequenz der Matrize bestimmt werden. Pyrogramm wird zur Generierung der Nukleotidsequenz der Proben-DNA verwendet, wie in Abbildung 03 gezeigt.
Pyrosequencing ist sehr wichtig bei der Analyse von Einzelnukleotid-Polymorphismen und der Sequenzierung kurzer DNA-Abschnitte. Die hohe Genauigkeit, Flexibilität, einfache Automatisierung und Parallelverarbeitung sind die Vorteile der Pyrosequenzierung gegenüber Sanger-Sequenzierungstechniken.
Abbildung 03: Pyrosequenzierung
Was ist der Unterschied zwischen Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung?
Sanger-Sequenzierung vs. Pyrosequenzierung |
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| Sanger-Sequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem selektiven Einbau von ddNTPs durch DNA-Polymerase und Kettenabbruch basiert. | Pyrosequencing ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem Nachweis der Freisetzung von Pyrophosphat nach Einbau von Nukleotiden basiert. |
| Verwendung von ddNTP | |
| ddNTPs werden verwendet, um die DNA-Replikation zu beenden | ddNTPs werden nicht verwendet. |
| Beteiligte Enzyme | |
| DNA-Polymerase werden verwendet. | Vier Enzyme werden verwendet: DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase. |
| Verwendete Substrate | |
| APS und Luciferin werden nicht verwendet. | Adenosin-5'-Phosphosulfat (APS) und Luciferin werden verwendet. |
| Maximale Temperatur | |
| Dies ist ein langsamer Vorgang. | Dies ist ein schneller Vorgang. |
Zusammenfassung – Sanger-Sequenzierung vs. Pyrosequenzierung
Sanger-Sequenzierung und Pyrosequenzierung sind zwei DNA-Sequenzierungsmethoden, die in der Molekularbiologie verwendet werden. Die Sanger-Sequenzierung konstruiert die Reihenfolge der Nukleotide in der Sequenz, indem die Kettenverlängerung beendet wird, während die Pyrosequenzierung die genaue Reihenfolge der Nukleotide in der Sequenz durch Einbau von Nukleotiden und Nachweis der Freisetzung von Pyrophosphaten konstruiert. Daher besteht der Hauptunterschied zwischen der Sanger-Sequenzierung und der Pyrosequenzierung darin, dass die Sanger-Sequenzierung auf die Sequenzierung durch Kettenabbruch wirkt, während die Pyrosequenzierung auf die Sequenzierung durch Synthese wirkt.
