Hauptunterschied – RT-PCR vs. QPCR
Polymerase-Kettenreaktion ist eine Technik zur Amplifikation einer bestimmten DNA-Region in vitro. Aufgrund der Erfindung dieser Technik durch Kary Mullis im Jahr 1983 sind Wissenschaftler in der Lage, Tausende bis Millionen Kopien spezifischer DNA-Fragmente für Forschungszwecke herzustellen. Derzeit ist es eine übliche und routinemäßig durchgeführte Technik in klinischen und Forschungslabors für eine Vielzahl von Anwendungen geworden. Es gibt Variationen der traditionellen PCR-Technik wie RT-PCR, verschachtelte PCR, Multiplex-PCR, Q-PCR, RT – QPCR usw. RT-PCR und Q-PCR sind zwei wichtige Variationen der PCR. Der Hauptunterschied zwischen RT-PCR und Q-PCR besteht darin, dass RT-PCR zum Nachweis der Genexpression durch Erstellung komplementärer DNA-Transkripte (cDNA) aus RNA verwendet wird, während Q-PCR verwendet wird, um die PCR-Produkte in Echtzeit unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen quantitativ zu messen.
Was ist RT-PCR?
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Variante der PCR, die zum Nachweis der RNA-Expression verwendet wird. Es ist eine sehr wichtige Methode zum Nachweis der mRNA-Expression in Geweben. RT-PCR wird eingesetzt, wenn das Ausgangsmaterial der Probe RNA ist. Bei der RT-PCR wird die Template-mRNA zunächst in komplementäre DNA umgewandelt. Dieser Schritt wird durch das Enzym Reverse Transkriptase katalysiert und der Prozess ist als Reverse Transkription bekannt. Zweitens wird traditionelle PCR für die neu synthetisierte cDNA für die Amplifikation verwendet.
RT-PCR ist eine hochempfindliche Technik, die eine relativ kleine Menge an RNA-Probe erfordert. RT-PCR wird häufig zur Diagnose und Quantifizierung von RNA-Spezies verwendet, insbesondere von RNA-Viren wie dem humanen Immunschwächevirus und dem Hepatitis-C-Virus.
Abbildung 01: RT-PCR-Technik
Was ist QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) ist eine Variante der PCR, mit der die PCR-Produkte quantitativ gemessen werden. Es wird auch als Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet, da es die Amplifikation von Echtzeit unter Verwendung einer Echtzeit-PCR-Maschine misst. Es ist ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Zielsequenz oder eines Gens, die in einer Probe vorhanden ist. Das interessante Merkmal von QPCR ist, dass es sowohl Amplifikation als auch echte Quantifizierung in einem einzigen Schritt kombiniert. Daher kann die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese beim Nachweis durch die QPCR-Technik eliminiert werden. QPCR verwendet fluoreszierende Farbstoffe, um PCR-Produkte während der PCR-Reaktionen zu markieren, was schließlich zu einer direkten Quantifizierung führt. Wenn sich die PCR-Produkte ansammeln, werden auch die Fluoreszenzsignale angesammelt und von der Echtzeitmaschine gemessen. QPCR kann mit RT-PCR kombiniert werden. Sie ist als RT – QPCR oder QRT – PCR bekannt und gilt als die leistungsstärkste, empfindlichste und quantitative Methode zum Nachweis von RNA-Spiegeln in Zellen oder Geweben.
SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden, die verwendet werden, um den Amplifikationsprozess der Echtzeit-PCR zu erkennen oder zu beobachten. Die SYBR Green-Methode wird unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs namens SYBR Green durchgeführt und erkennt die Amplifikation durch Bindung des Farbstoffs, um doppelsträngige DNA zu produzieren. Taqman wird unter Verwendung doppelt markierter Sonden durchgeführt und weist die Amplifikation durch Abbau der Sonde durch Taq-Polymerase und Freisetzungen des Fluorophors nach, wie in Abbildung 02 gezeigt. Beide Methoden überwachen den Fortschritt des Amplifikationsprozesses und melden die Menge des Produkts in Echtzeit.
Echtzeit-PCR hat eine Vielzahl von Anwendungen wie Genexpressionsquantifizierung, microRNA- und nichtkodierende RNA-Analyse, SNP-Genotypisierung, Erkennung von Kopienzahlvarianten, Erkennung seltener Mutationen, Erkennung genetisch veränderter Organismen, Erkennung von Infektionserregern, etc.
Abbildung 02: Quantitative PCR-Technik
Was ist der Unterschied zwischen RT-PCR und QPCR?
RT-PCR vs. QPCR |
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| RT-PCR ist eine Technik zum Nachweis der Genexpression durch Amplifikation. | QPCR ist eine Technik, die DNA amplifiziert und die PCR-Produkte in Echtzeit quantifiziert. |
| Beteiligung des Reverse-Transkriptase-Enzyms | |
| Enzym reverse Transkriptase wird für die RT-PCR verwendet. | Enzym reverse Transkriptase wird nicht für QPCR verwendet. |
| Verwendung fluoreszierend markierter Moleküle | |
| Fluoreszenzmarkierte Farbstoffe oder Sonden werden nicht für die RT-PCR verwendet. | Fluoreszenzmarkierte Farbstoffe oder Sonden werden für die QPCR verwendet. |
| Quantifizierung des PCR-Produkts | |
| Wenn nicht mit QPCR gekoppelt, quantifiziert die RT-PCR das PCR-Produkt nicht. | QPCR misst das PCR-Produkt quantitativ. |
| Ausgangsmaterial | |
| Ausgangsmaterial ist mRNA. | Ausgangsmaterial ist DNA. |
| Synthese von cDNA | |
| Bei der RT-PCR wird komplementäre DNA produziert. | Bei der QPCR wird keine komplementäre DNA produziert. |
Zusammenfassung – RT-PCR vs. QPCR
RT PCR und QPCR sind zwei Versionen der traditionellen PCR. Die RT-PCR-Technik wird für mRNA-Proben durchgeführt und wird durch reverse Transkription und Produktion von cDNA angetrieben. QPCR wird verwendet, um PCR-Produkte während der Echtzeit-PCR-Thermozyklen unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen oder markierten Sonden zu quantifizieren. Bei der QPCR wird die Menge an PCR-Produkt durch die von der Probe emittierten Fluoreszenzsignale dargestellt. RT-PCR wird im Allgemeinen als Amplifikationsprozess verwendet, während QPCR häufig als Quantifizierungsprozess verwendet wird. Dies ist der Unterschied zwischen RT-PCR und QPCR.
