Hauptunterschied – Warme vs. k alte Trypsinisierung
Warm- und K alttrypsinisierung sind zwei Methoden, die bei der enzymatischen Disaggregation von Zellen in der Tierzellkultivierung verwendet werden. Der Hauptunterschied zwischen warmer und k alter Trypsinierung hängt, wie der Name schon sagt, von der Temperatur ab, bei der das Trypsin für die zelluläre Disaggregation hinzugefügt wird. Die Warmtrypsinisierung findet unter höheren Temperaturbedingungen statt (36,5 – 37 0C), während die K alttrypsinisierung unter Niedrigtemperaturbedingungen stattfindet.
Während des Prozesses der primären Zellkultivierung tierischer Zellen werden hauptsächlich drei Methoden verwendet, die sich als erfolgreich erwiesen haben. Die drei Verfahren umfassen die mechanische Desaggregation von Zellen, die enzymatische Desaggregation von Zellen und die primäre Explantationstechnik. Die enzymatische Desaggregation von Zellen, die zur Isolierung von Zellen führt, wird durch das proteinabbauende Enzym Trypsin durchgeführt. Daher wird dieser Vorgang als Trypsinisierung bezeichnet. Die Trypsinisierung kann unter zwei verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden, nämlich Warmtrypsinisierung und K alttrypsinisierung. Die Warmtrypsinisierung ist die Methode der Behandlung der Zellen mit Trypsin unter warmen Bedingungen bei einer Temperatur von 36,5 – 37 0C. K alte Trypsinisierung ist der Prozess der Trypsinbehandlung, der unter kälteren Bedingungen stattfindet, vorzugsweise in Eis, wobei sehr niedrige Temperaturen beibeh alten werden.
Was ist Warmtrypsinisierung?
Trypsinisierung kann durchgeführt werden, um die zellulären Komponenten zu disaggregieren, um die Zellen zu isolieren und eine primäre Zellkultur herzustellen. Trypsin ist ein proteinabbauendes Enzym, und das bei der Trypsinisierung verwendete Enzymgemisch kann entweder ein Rohextrakt oder ein gereinigtes Produkt sein. Der Rohextrakt soll bei der Proteinlyse und dem Zellaufschluss effizienter sein, da er andere abbauende Enzyme enthält.
Die warme Trypsinisierung ist die am häufigsten verwendete enzymatische Methode zur Zellauflösung, die unter höheren Temperaturbedingungen stattfindet. Vor der Behandlung durch Trypsinisierung wird das gewünschte Gewebe in kleinere Stücke zerhackt. Es erleichtert den einfachen Disaggregationsprozess. Das gehackte Gewebe wird dann in einem speziellen Medium gewaschen, das als Dissection Basal S alt Medium bekannt ist.
Nach Abschluss des Waschschritts werden die Zellen in einen Kolben umgewandelt, der das aktive Enzym Trypsin enthält. Da diese Technik ein warmes Trypsinisierungsprotokoll impliziert, wird das Trypsin etwa vier Stunden lang bei einer Temperatur von etwa 37 0C geh alten.
Abbildung 01: Trypsin
Der Inh alt wird gemischt und gerührt, indem Zentrifugationsmethoden verwendet werden, um das Protokoll zu vereinfachen und den Disaggregationsprozess zu beschleunigen. Sobald die empfohlene Zeit erreicht ist, können die Zellen aus dem Überstand gewonnen werden. Die aus dem Überstand gewonnenen Zellen werden dann bei einer bestimmten Temperatur und Zeit inkubiert.
Was ist K alttrypsinisierung?
K alte Trypsinisierung ist die andere Art der Trypsinisierung, die unter k alten Bedingungen stattfindet. Bei dieser Technik werden die zerkleinerten und gewaschenen Zellen in Fläschchen auf Eis gegeben und dann mit Trypsin getränkt. Die Einweichzeit ist viel länger – etwa 6 – 24 Stunden.
Nach Abschluss des Einweichvorgangs wird das Trypsin aus dem Zelllysat entfernt und die Gewebestücke werden bei 37 0C für ca. 20 – 30 Minuten weiter inkubiert. Die Desaggregation der Zellen wird durch mehrmaliges Pipettieren des Gewebegemisches bewirkt. Dadurch können sich die Zellen von der Membran lösen und in den Überstand gelangen. Sobald sich die Zellen im Überstand befinden, werden sie inkubiert und bei einer gewünschten Temperatur und einem gewünschten Zeitraum gezüchtet.
Die Methode der K alttrypsinierung hat mehrere Vorteile
- Höhere Ausbeute an lebensfähigen Zellen, da die Zellschädigung minimiert wird. Der Zellschaden wird minimiert, indem keine Zentrifugationsschritte verwendet werden.
- Sehr praktische Methode.
- Weniger mühsam.
Die Haupteinschränkung der K alttrypsinierungsmethode besteht darin, dass große Mengen nicht auf einmal verwendet werden können.
Was sind die Ähnlichkeiten zwischen warmer und k alter Trypsinisierung?
- Sowohl warme als auch k alte Trypsinisierungsprozesse verwenden das Enzym Trypsin zur Auflösung von Zellen.
- Sowohl Warm- als auch K alttrypsinisierungsverfahren werden in Zellkulturverfahren zur Auflösung von Zellen verwendet.
- Bei Behandlungsverfahren sowohl mit warmer als auch mit k alter Trypsinisierung werden die Zellen aus dem Überstand gewonnen.
Was ist der Unterschied zwischen warmer und k alter Trypsinierung?
Warme vs. k alte Trypsinisierung |
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| Warmtrypsinisierung ist die Methode der Behandlung der Zellen mit Trypsin unter warmen Bedingungen bei einer Temperatur von 36,5 – 37 0. | K alte Trypsinisierung ist der Prozess der Trypsinbehandlung, der unter kälteren Bedingungen stattfindet, vorzugsweise in Eis bei sehr niedrigen Temperaturen. |
| Protokoll | |
| Die geschnittenen Gewebestücke werden während des gesamten Verfahrens kontinuierlich auf 37 0C geh alten. | Die zerkleinerten Gewebestücke werden zunächst bei eisk alten Temperaturen geh alten und dann bei 37 0. |
| Temperatur | |
| Warme Trypsinisierung erfolgt bei 36,5 – 37 0 | K alte Trypsinierung tritt bei eisk alten Temperaturen auf. |
| Zeitaufwand | |
| Weniger Zeitaufwand für den gesamten Vorgang (ca. 4 Stunden) der warmen Trypsinisierung. | Längerer Zeitaufwand (ca. 6 – 24 Stunden) für K alttrypsinisierung. |
| Ausbeute lebensfähiger Zellen | |
| Gering in warmer Trypsinisierung. | Hoch in der Kältetrypsinisierung. |
| Zentrifugation | |
| Zentrifugation ist für die Desaggregation von Zellen in warmer Trypsinisierung erforderlich. | Zentrifugation ist bei der K alttrypsinisierung nicht erforderlich. |
| Anfängliche Gewebemenge für die Trypsinisierung | |
| Bei der warmen Trypsinisierung kann eine größere Gewebemenge verwendet werden. | Bei der K alttrypsinisierung kann eine kleinere Gewebemenge verwendet werden. |
| Zellschaden | |
| Hoch durch Zentrifugation bei warmer Trypsinisierung. | Weniger durch K alttrypsinisierung. |
Zusammenfassung – Warme vs. k alte Trypsinisierung
Trypsinisierung ist die Methode der Verwendung des proteinabbauenden Enzyms Trypsin zur Disaggregation und Vorbereitung primärer Zellkulturen während des Zellkultivierungsprozesses. Es gibt zwei Haupttechniken der Trypsinisierung, basierend auf den Temperaturen, die während des Verfahrens verwendet werden. Sie sind warm und k alt trypsiniert. Die warme Trypsinierung wird bei 37 °C durchgeführt, während die k alte Trypsinierung unter eisk alten Bedingungen durchgeführt wird. Obwohl die k alte Trypsinierung länger dauert, bis sie abgeschlossen ist, soll sie eine höhere Ausbeute an lebensfähigen Zellen haben. Dies liegt an der Tatsache, dass die Zellschädigung bei der k alten Trypsinisierung minimiert wird, da sie keine kräftigen Zentrifugationsschritte verwendet. Dies ist der Unterschied zwischen warmer und k alter Trypsinierung.
