Hauptunterschied – Northern vs. Southern vs. Western Blotting
Der Nachweis spezifischer DNA-, RNA- und Proteinsequenzen ist für verschiedene Arten von Studien in der Molekularbiologie unerlässlich. Gelelektrophorese ist eine Technik, die DNA, RNA und Proteine nach ihrer Größe trennt. Aus den Gelprofilen werden bestimmte DNA-Sequenzen, RNA-Sequenzen oder Proteine durch spezielle Techniken, die Blotting und Hybridisierung mit markierten Sonden genannt werden, nachgewiesen. Es gibt drei verschiedene Arten von Blotting-Methoden, nämlich Southern, Northern und Western. Der Hauptunterschied zwischen Northern-Southern- und Western-Blotting liegt in der Art des Moleküls, das es aus einer Probe erkennt. Southern Blotting ist ein Verfahren, das eine spezifische DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe nachweist. Northern Blotting ist eine Technik, die eine spezifische RNA-Sequenz aus einer RNA-Probe nachweist. Western Blotting ist eine Methode, die ein spezifisches Protein aus einer Proteinprobe nachweist.
Was ist Southern Blotting?
Die Southern-Blotting-Technik wurde 1975 von E. M. Southern zur Identifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe entwickelt. Dies ist die erste in der Molekularbiologie eingeführte Blotting-Technik. Es ermöglichte den Nachweis spezifischer Gene aus der DNA, spezifischer DNA-Fragmente usw. Die Southern-Blotting-Technik umfasst mehrere Schritte. Sie lauten wie folgt.
- DNA wird aus der Probe isoliert und mit Restriktionsendonukleasen verdaut.
- Die aufgeschlossene Probe wird durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt.
- DNA-Fragmente im Gel werden mit einer alkalischen Lösung zu Einzelsträngen denaturiert.
- Einzelsträngige DNA wird durch Kapillartransfer auf eine Nitrozellulose-Filtermembran übertragen.
- Übertragene DNA wird dauerhaft auf der Membran fixiert.
- Auf der Membran fixierte DNA wird mit markierten Sonden hybridisiert.
- Ungebundene DNA wird durch Waschen von der Membran abgewaschen.
- Röntgenfilm wird auf die Membran gelegt und eine Autoradiographie angefertigt.
Southern Blotting wird für verschiedene Aspekte der Molekularbiologie eingesetzt. Es ist nützlich bei der RFLP-Kartierung, forensischen Studien, der DNA-Methylierung bei der Genexpression, dem Nachweis mutierter Gene bei genetischen Störungen, dem DNA-Fingerabdruck usw.
Abbildung 01: Southern-Blotting-Technik
Was ist Northern Blotting?
Northern Blotting ist eine Methode zum Nachweis einer bestimmten RNA-Sequenz oder mRNA-Sequenz aus einer Probe, um die Genexpression zu untersuchen. Diese Technik wurde 1979 von Alwine, Kemp und Stark entwickelt. Sie unterscheidet sich von den Southern- und Western-Blotting-Techniken durch mehrere Schritte. Diese Technik wird jedoch auch über Gelelektrophorese, Blotting und Hybridisierung mit spezifisch markierten Sonden und Nachweis durchgeführt. Die Northern-Blotting-Technik wird wie folgt durchgeführt.
- RNA wird aus der Probe extrahiert und gelelektrophoretisch aufgetrennt.
- RNA wird aus dem Gel auf eine Blotting-Membran übertragen und fixiert.
- Die Membran wird mit einer markierten Sonde behandelt, die aus cDNA oder RNA hergestellt wurde (die Sonde ist komplementär zu einer spezifischen Sequenz in der Probe).
- Die Sonde wird mit der Membran inkubiert, um an eine spezifische Sequenz zu binden.
- Ungebundene Sonden werden abgewaschen.
- Hybridisierte Fragmente werden durch ein Autoradiogramm nachgewiesen.
Northern Blotting ist ein wichtiges Werkzeug zum Nachweis und zur Quantifizierung hybridisierter mRNA, zur Untersuchung des RNA-Abbaus, zur Bewertung der RNA-Halbwertszeit, zum Nachweis von RNA-Spleißen, zur Untersuchung der Genexpression usw.
Abbildung 02: Northern Blotting
Was ist Western Blotting?
Western Blotting ist eine Methode zum Nachweis eines spezifischen Proteins aus einem Proteingemisch durch die Verwendung von markierten Antikörpern. Daher wird der Western Blot auch als Immunoblot bezeichnet. Diese Technik wurde 1979 von Towbin et al. eingeführt und wird heute routinemäßig in den Labors zur Proteinanalyse durchgeführt. Die Schritte sind wie folgt.
- Proteine werden aus der Probe extrahiert
- Proteine werden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach ihrer Größe aufgetrennt
- Getrennte Moleküle werden durch Elektroporation in eine PVDF-Membran oder Nitrozellulosemembran überführt
- Die Membran wird für die unspezifische Bindung mit den Antikörpern blockiert
- Übertragene Proteine werden an den primären Antikörper gebunden (enzymmarkierte Antikörper).
- Die Membran wird gewaschen, um unspezifisch gebundene Primärantikörper zu entfernen
- Gebundene Antikörper werden durch Zugabe eines Substrats und Nachweis des gebildeten farbigen Niederschlags nachgewiesen
Western-Blotting eignet sich zum Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern in einer menschlichen Serumprobe. Western Blot kann auch als Bestätigungstest für eine Hepatitis-B-Infektion und als endgültiger Test für Rinderwahn verwendet werden.
Abbildung 03: Western Blotting
Was ist der Unterschied zwischen Northern Southern und Western Blotting?
Northern vs. Southern vs. Western Blotting |
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| Art des nachgewiesenen Moleküls | |
| Northern Blotting | Northern Blotting erkennt eine spezifische RNA-Sequenz aus einer RNA-Probe. |
| Southern Blotting | Southern Blot erkennt eine spezifische DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe. |
| Western Blotting | Western Blot erkennt ein spezifisches Protein aus einer Proteinprobe. |
| Geltyp | |
| Northern Blotting | Hier wird Agarose/Formaldehyd-Gel verwendet. |
| Southern Blotting | Hierbei wird ein Agarose-Gel verwendet. |
| Western Blotting | Hier wird Polyacrylamid-Gel verwendet. |
| Blotting-Methode | |
| Northern Blotting | Dies ist ein Kapillartransfer. |
| Southern Blotting | Dies ist ein Kapillartransfer. |
| Western Blotting | Dies ist eine elektrische Übertragung. |
| Verwendete Sonden | |
| Northern Blotting | cDNA- oder RNA-Sonden, radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert. |
| Southern Blotting | DNA-Sonden sind radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert. |
| Western Blotting | Primäre Antikörper werden als Sonden verwendet. |
| Erkennungssystem | |
| Northern Blotting | Dies geschieht mithilfe eines Autoradiogramms oder der Erkennung von Licht- oder Farbveränderungen. |
| Southern Blotting | Dies geschieht mit einem Autoradiogramm, Nachweis von Licht oder Farbveränderung. |
| Western Blotting | Dies geschieht über die Erkennung von Licht- oder Farbveränderungen. |
Zusammenfassung – Northern vs. Southern vs. Western Blotting
Blotting ist eine spezielle Technik, die für die Identifizierung spezifischer DNA, RNA oder Proteine aus den Proben entwickelt wurde. Es gibt drei separate Blotting-Verfahren, nämlich Northern, Southern und Western, um einen bestimmten Molekültyp nachzuweisen. Die Northern-Blotting-Technik dient zum Nachweis einer spezifischen RNA-Sequenz aus einem RNA-Gemisch. Die Southern-Blotting-Technik ermöglicht den Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz aus einer DNA-Probe und die Western-Blotting-Technik wurde entwickelt, um ein spezifisches Protein aus einer Proteinmischung zu identifizieren.
