Hauptunterschied – Nitrocellulose vs. PVDF
Western Blotting ist eine Methode, die den Nachweis und die Quantifizierung spezifischer Proteine aus einer Proteinprobe ermöglicht. Die Zuverlässigkeit der Technik hängt von der Auswahl einer richtigen Membran zur Absorption von Proteinen aus dem Gel ab. Es gibt verschiedene Arten von mikroporösen Membranen. Nitrozellulose- und PVDF-Membranen sind zwei solche Membranen, die von den Forschern aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften gegenüber den anderen Membrantypen bevorzugt werden. Die Auswahl zwischen Nitrocellulose oder PVDF ist auch eine weitere Herausforderung beim Western Blotting. Sowohl Nitrocellulose als auch PVDF haben eine hohe Proteinabsorptionskapazität. Der Hauptunterschied zwischen Nitrozellulose- und PVDF-Membranen besteht darin, dass Nitrozellulosemembranen nicht in der Lage sind, Antikörper abzustreifen und die Membran für die erneute Untersuchung von Antikörpern wiederzuverwenden, während PVDF-Membranen die Fähigkeit zum Abstreifen und Wiederverwenden haben.
Was ist Nitrocellulose?
Nitrocellulose ist ein Polymer, das durch Behandlung von Cellulose mit Salpetersäure hergestellt wird und zur Herstellung mikroporöser Membranen in der Molekularbiologie verwendet wird, insbesondere für Blotting-Techniken wie Southern-, Northern- und Western-Blotting. Die Porengrößen von Nitrozellulosemembranen liegen im Bereich von 3 bis 20 µm. Mikroporöse Nitrozellulosemembranen erleichtern den Nachweis einer immunchemischen Reaktion, die auf der Oberfläche der Membran stattfindet. Daher werden Nitrozellulosemembranen häufig zur Immobilisierung von Proteinen und zum Nachweis spezifischer Proteine beim Western Blotting verwendet. Nitrozellulosemembranen können auch Glykoproteine und Nukleinsäuren immobilisieren.
Nitrozellulosemembranen werden aufgrund mehrerer Merkmale in Lateral-Flow-Assays bevorzugt. Nitrozellulosemembranen absorbieren Proteine in hoher Konzentration. Das zum Benetzen der Membran verwendete Lösungsmittel verringert die Proteinabsorption der Nitrozellulosemembran nicht. Nitrozellulosemembranen lassen sich leicht auf die gewünschte Gelgröße zuschneiden und übertragen Proteine vom Gel auf die Membran durch Elektro- oder Kapillartransfer. Nitrocellulose ermöglicht einen schnelleren Fluss von Proteinen durch die Membran mit hohem Bindungspotential. Nitrocellulose zeigt eine verbesserte Handhabungsfestigkeit. Ein weiteres besonderes Merkmal der Nitrozellulosemembran ist, dass sie leicht mit lösungsmittelfreien, wasserbeständigen Klebstoffen auf verschiedene Kunststoffträger geklebt werden kann.
Abbildung 01: Nitrozellulosemembran für Western Blotting
Was ist PVDF?
Polyvinylidendifluorid (PVDF) ist ein Fluorpolymer, das durch Polymerisation von Vinylidendifluorid hergestellt wird und eine hohe Fähigkeit zur Immobilisierung von Proteinen hat. Daher werden mikroporöse Membranen aus PVDF in Western-Blotting-Techniken verwendet, um spezifische Proteine aus Proteingemischen zu analysieren. PVDF-Membranen können auch für die Aminosäureanalyse und Proteinsequenzierung verwendet werden. Das wichtigste Merkmal der PVDF-Membran über der Nitrozellulosemembran ist, dass sie leicht von den Antikörpern abgezogen und für nachfolgende Antikörpersonden wiederverwendet werden kann.
PVDF-Membranen sind dicker als Nitrozellulosemembranen; daher widerstandsfähiger gegen Beschädigungen während der Wiederverwendung. PVDF-Membranen sind stark hydrophob. Daher müssen sie vor Gebrauch in Methanol oder Isopropanol eingeweicht werden.
Was ist der Unterschied zwischen Nitrocellulose und PVDF?
Nitrocellulose vs. PVDF |
|
| Nitrocellulose ist ein Polymer aus Cellulose. | PVDF ist ein Fluorpolymer, das durch Polymerisation von Vinylidendifluorid hergestellt wird. |
| Membranporengröße | |
| Typische Porengrößen sind 0,1, 0,2 oder 0,45μ | Typische Porengrößen sind 0,1, 0,2 oder 0,45 μm |
| Proteinbindungskapazität | |
| Nitrocellulose hat eine Proteinbindungskapazität von 80 bis 100 μg/cm2. | PVDF hat eine Proteinbindungskapazität von 170 bis 200 μg/cm2. |
| Empfindlichkeit | |
| Dies hat eine geringe Empfindlichkeit im Vergleich zu PVDF. | Dies hat eine hohe Empfindlichkeit. |
| Nachweis schwach exprimierter Proteine | |
| Da die Sensitivität von Nitrozellulosemembranen gering ist, ist sie nicht zum Nachweis von schwach exprimierten Proteinen geeignet. | Dies ist aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit besser für den Nachweis von schwach exprimierten Proteinen geeignet. |
| Hintergrundgeräusche | |
| Dies hat weniger Hintergrundgeräusche | Dies hat ein höheres Hintergrundrauschen. |
| Wechselwirkungen mit Proteinen | |
| Proteinmoleküle binden durch hydrophobe Wechselwirkungen an Nitrozellulosemembranen. | Proteine binden durch hydrophobe und Dipol-Wechselwirkungen an PVDF-Membranen. |
| Natur der Membran | |
| Nitrocellulose ist spröde und zerbrechlich. Es sind jedoch Versionen von Nitrocellulose erhältlich, die beständig sind. | PVDF ist langlebiger und hat eine höhere chemische Beständigkeit. |
| Fähigkeit zum Strippen und Wiederverwenden | |
| Nitrozellulose kann Schwierigkeiten beim Strippen und erneuten Sondieren haben, ohne das Signal zu verlieren. | PVDF ist ideal für Resonding- und Sequenzierungsanwendungen. |
| Eignung | |
| Nitrocellulose ist ideal zum Nachweis niedermolekularer Proteine. | PVDF eignet sich besser zum Nachweis höhermolekularer Proteine. |
| Andere Verwendungen | |
| Nitrocellulose kann für Nukleinsäureanalysen und Dot/Slot-Blotting verwendet werden. | PVDF kann für die Proteinsequenzierung und Festphasen-Assaysysteme verwendet werden. |
| Kosten | |
| Das ist billiger als PVDF-Membranen. | Das ist teurer als Nitrozellulosemembranen. |
| Befeuchtung erforderlich | |
| Nitrozellulosemembranen müssen nicht mit Methanol vorgetränkt werden | PVDF-Membranen müssen mit Methanol vorgetränkt werden. |
Zusammenfassung – Nitrocellulose vs. PVDF
Nitrozellulosemembranen waren die ersten Membranen, die kommerziell für Lateral-Flow-Assays verwendet wurden. Sie haben eine hohe Kapazität zur Aufnahme von Proteinen. Daher werden beim Western Blotting Nitrozellulosemembranen verwendet. PVDF ist ein weiterer Membrantyp, der beim Western Blotting verwendet wird und ebenfalls eine hohe Proteinabsorptionskapazität aufweist. Beide Typen werden im Western Blot zur Proteinanalyse verwendet. PVDF-Membranen haben jedoch speziellere Eigenschaften, wodurch sie für Western Blotting besser geeignet sind als Nitrozellulosemembranen. Nitrozellulosemembranen sind jedoch besser zum Nachweis von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht geeignet, PVDF-Membranen sind besser zum Nachweis von Proteinen mit hohem Molekulargewicht geeignet. Dies ist der Unterschied zwischen Nitrozellulose- und PVDF-Membranen.
