Der Hauptunterschied zwischen Golden Gate und Gibson Assembly besteht darin, dass Golden Gate auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz angewiesen ist, während Gibson Assembly nicht auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten Sequenz angewiesen ist geklont werden.
In den letzten Jahrzehnten haben Molekularwissenschaftler verschiedene standardisierte Verfahren entwickelt, die es ermöglichen, mehrere DNA-Fragmente einfacher zu einem einzigen Stück zusammenzusetzen. Daher werden Klonierungsmethoden wie Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly und TOPO Cloning von Forschern in wissenschaftlichen Experimenten häufig verwendet. Daher sind Golden Gate und Gibson Assembly zwei molekulare Klonierungsmethoden, die den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück ermöglichen.
Was ist die Golden Gate Assembly?
Golden Gate ist eine molekulare Klonierungsmethode, die den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück erleichtert. Dieses Verfahren beruht auf dem Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz. Es entstand 1996. Diese Technik verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase. Diese Enzyme schneiden DNA außerhalb der Erkennungsstellen. Sie können nicht-palindromische Überhänge erzeugen. Daher können mehrere DNA-Fragmente unter Verwendung von Kombinationen von Überhangsequenzen zusammengesetzt werden.
Abbildung 01: Golden Gate
Montageverfahren bei Golden Gate
Die Golden-Gate-Technik besteht aus drei Hauptschritten in ihrem Verfahren:
- Bildung von Überhängen im Klonvektor,
- Zusammenbau mehrerer DNA-Inserts durch Verwendung fragmentspezifischer Sequenzen in Überhängen und
- Verbindung.
Golden Gate Assembly verwendet kreisförmige Klonierungsvektoren (Zielvektor). Außerdem wird bei diesem Verfahren die Restriktionsstelle aus dem ligierten Produkt eliminiert, um den Verdau und die Ligation gleichzeitig durchzuführen. Ein typisches Wärmezyklusprotokoll für Golden Gate oszilliert zwischen 37 °C und 16 °C, da 37 °C optimal für Restriktionsenzyme und 16 °C optimal für Ligasen sind.
Was ist Gibson Assembly?
Gibson Assembly ist eine molekulare Klonierungsmethode, die den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück ermöglicht. Anders als das Golden-Gate-Verfahren beruht dieses Verfahren nicht auf dem Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz. Es wurde von Daniel G. Gibson vom J. Craig Venter Institute gefunden. Diese Technik ist eine Art Sequenz- und Ligase-unabhängige Klonierungsmethode (SLIC).
Abbildung 02: Gibson Assembly
Gibson Montageverfahren
Gibson Assembly benötigt DNA-Fragmente mit 20-40 Basenpaaren, die sich mit benachbarten DNA-Fragmenten überlappen. Überlappungen werden über PCR hinzugefügt. Dann werden diese DNA-Fragmente zu der Gibson-Maser-Mischung hinzugefügt, die drei Enzyme enthält. Dieses Verfahren wird unter isothermen Bedingungen (50 °C für 1 Stunde) unter Verwendung von drei verschiedenen Enzymen durchgeführt: Exonuklease, DNA-Polymerase und DNA-Ligase. Die Exonuklease kaut DNA vom 5'-Ende zurück. Somit hemmt es die Polymerase-Aktivität nicht und lässt die Reaktion in einem einzigen Prozess ablaufen. Die resultierenden einzelsträngigen Regionen auf benachbarten DNA-Fragmenten können aufgrund überlappender Sequenzen anneliert werden. Die DNA-Polymerase füllt die Lücken, indem sie Nukleotide hinzufügt. Schließlich verbindet die DNA-Ligase die DNA benachbarter Segmente kovalent. Normalerweise verwendet Gibson Assembly linearisierte Zielvektoren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren aufgrund der Sequenzähnlichkeit bis zu 15 DNA-Fragmente gleichzeitig kombinieren.
Ähnlichkeiten zwischen Golden Gate und Gibson Assembly
- Golden Gate und Gibson Assembly sind zwei molekulare Klonierungsmethoden.
- Beide Methoden können mehrere DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück zusammenfügen.
- Diese Methoden verwenden Zielvektoren.
- Beide Methoden verwenden Thermocycler für den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente.
- Sie werden in der ortsgerichteten Mutagenese verwendet.
Unterschied zwischen Golden Gate und Gibson Assembly
Golden Gate ist eine molekulare Klonierungsmethode, die beim Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück verwendet wird und sich auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonenden Sequenz stützt, während Gibson Assembly eine molekulare Klonierungsmethode ist, die in der verwendet wird Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück, ohne sich auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz zu verlassen. Dies ist der Hauptunterschied zwischen Golden Gate und Gibson Assembly. Darüber hinaus verwendet die Golden-Gate-Methode einen kreisförmigen Zielvektor, während die Gibson-Assembly-Methode einen linearisierten Zielvektor verwendet.
Die folgende Infografik zeigt den Unterschied zwischen Golden Gate und Gibson Assembly.
Zusammenfassung – Golden Gate vs. Gibson Assembly
Molekulares Klonen ist eine Methode, die verwendet wird, um rekombinante DNA-Moleküle zusammenzusetzen und ihre Replikation innerhalb von Wirtsorganismen zu steuern. Golden Gate und Gibson Assembly sind zwei molekulare Klonierungsmethoden, die den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück ermöglichen. Das Golden-Gate-Verfahren beruht auf dem Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz, während Gibson Assembly nicht auf dem Vorhandensein von Restriktionsstellen innerhalb einer bestimmten zu klonierenden Sequenz beruht. Dies ist also der Hauptunterschied zwischen Golden Gate und Gibson Assembly.
