Hauptunterschied – SYBR Green vs. Taqman
SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden, die verwendet werden, um den Amplifikationsprozess der Echtzeit-PCR zu erkennen oder zu beobachten. SYBR Green ist eine Methode, die auf der Interkalation von Nukleinsäure-Färbefarbstoffen basiert, während Taqman eine Methode ist, die auf einer Hydrolysesonde basiert. Beide Technologien sind so konzipiert, dass sie während der PCR Fluoreszenz erzeugen, wodurch eine Echtzeit-PCR-Maschine die Reaktion in „Echtzeit“überwachen kann. Die SYBR Green-Methode wird unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs namens SYBR Green durchgeführt und erkennt die Amplifikation durch Bindung des Farbstoffs an die produzierte doppelsträngige DNA. Taqman wird unter Verwendung von doppelt markierten Sonden durchgeführt und weist die Amplifikation durch Abbau der Sonde durch Taq-Polymerase und Freisetzungen des Fluorophors nach. Dies ist der Hauptunterschied zwischen SYBR Green und Taqman.
Was ist SYBR Green?
SYBR Green ist ein fluoreszierender Farbstoff, der zur Färbung von Nukleinsäuren verwendet wird, insbesondere von doppelsträngiger DNA in der Molekularbiologie. Die SYBR Green-Methode wird zur Quantifizierung von PCR-Produkten während der Echtzeit-PCR verwendet. Sobald es sich an DNA bindet, absorbiert der resultierende DNA-Farbstoffkomplex blaues Licht und emittiert intensives grünes Licht. Dies geschieht aufgrund der strukturellen Veränderung, die im Farbstoffmolekül bei der Bindung an doppelsträngige DNA auftritt. Wenn die PCR immer mehr DNA erzeugt, binden mehr Farbstoffmoleküle an die DNA und erzeugen mehr Fluoreszenz. Daher nimmt die Fluoreszenz mit der Akkumulation des PCR-Produkts zu. Daher kann die Menge des PCR-Produkts quantitativ durch die SYBR-Green-Fluoreszenzdetektion gemessen werden.
SYBR grüner Farbstoff kann auch zur DNA-Markierung in der Zytometrie und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden. Ethidiumbromid wurde erfolgreich durch SYBR Green ersetzt, da Ethidiumbromid ein krebserregender Farbstoff mit Entsorgungsproblemen bei der DNA-Visualisierung in der Gelelektrophorese ist.
Es gibt Vor- und Nachteile der grünen SYBR-Methode. Diese Methode ist sehr empfindlich, kostengünstig und einfach anzuwenden. Aufgrund seiner Fähigkeit, an jede doppelsträngige DNA zu binden, kann eine unspezifische Bindung jedoch zu einer Überquantifizierung des PCR-Produkts führen.
Abbildung 01: SYBR Green Technique
Was ist Taqman?
Taqman ist eine alternative Methode zu SYBR Green zur Überwachung des Echtzeit-PCR-Prozesses. Diese Methode hängt von der 5’-3’-Exonuklease-Aktivität des Taq-Polymerase-Enzyms ab, um die Sonden während der Verlängerung des neuen Strangs und der Freisetzung des Fluorophors abzubauen. Bei diesem Verfahren werden doppelt markierte Sonden verwendet und es basiert auf der Hydrolyse von Sonden. Sonden sind fluoreszenzmarkierte DNA-Oligonukleotide mit einem fluoreszierenden Reportermolekül (Fluorophor) am 5'-Ende und einem Quencher-Molekül am 3'-Ende. Sie sind so konzipiert, dass sie an die einzelsträngige Matrize auf der gegenüberliegenden Seite der Primer-Anlagerung binden. Die Taq-Polymerase fügt dem Primer Nukleotide hinzu und verlängert den neuen Strang in Richtung der doppelt markierten Sonden. Sobald die Taq-Polymerase auf die Sonde trifft, aktiviert und baut die Exonukleasewirkung der Taq-Polymerase die Sonde ab. Sobald die Synthese des neuen Strangs abgeschlossen ist, wird die Sonde einem vollständigen Abbau unterzogen und setzt das Fluorophor frei. Die Freisetzung von Fluorophor erzeugt Fluoreszenz. Das fluoreszierende Quencher-Molekül löscht das emittierte Licht effizient und erzeugt die Ausgabe für die Quantifizierung des PCR-Produkts. Die Freisetzung von Fluorophoren und die Menge der PCR-Produkte sind proportional. Daher kann die Quantifizierung leicht mit der Taqman-Methode durchgeführt werden.
Abbildung 02: Taqman-Methode
Die Taqman-Methode wird in Echtzeit-PCR, Quantifizierung der Genexpression, Erkennung genetischer Polymorphismen, Quantifizierung chromosomaler DNA-Deletionen, Bakterienidentifizierung, Verifizierung der Microarray-Analyse, SNP-Genotypisierung usw. verwendet.
Was ist der Unterschied zwischen SYBR Green und Taqman?
SYBR Green gegen Taqman |
|
| SYBR Green basiert auf DNA-Bindungsfarbstoff. | Taqman hängt von Hybridisierungssonden und der 5'- bis 3'-Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase ab. |
| Fluoreszenzmarkierte Sonden | |
| Es sind keine fluoreszenzmarkierten Sonden erforderlich. | Doppelt markierte Sonden sind erforderlich. |
| Multiplex-Genanalyse | |
| Es kann nicht für Multiplex-Genziele verwendet werden. | Es kann für multiple Genziele verwendet werden. |
| Kosten | |
| Das ist günstiger. | Das ist teurer. |
| Spezifität | |
| Dies ist weniger spezifisch und bindet an jede doppelsträngige DNA | Diese sind hochspezifisch, da Sonden die spezifischen Amplifikationsprodukte nachweisen. |
| Wirksamkeit | |
| Das ist weniger effektiv. | Das ist sehr effektiv. |
| Bewerbung | |
| Dies wird in Echtzeit-PCR, Agarose-Gel-Visualisierung, DNA-Markierung usw. verwendet. | Dies wird bei Echtzeit-PCR, Quantifizierung der Genexpression, Erkennung genetischer Polymorphismen usw. verwendet. |
Zusammenfassung – SYBR Green und Taqman
Taqman und SYBR green sind zwei Methoden, die in der Echtzeit-PCR (quantitative PCR) eingesetzt werden. Beide Verfahren ermöglichen die effiziente Quantifizierung des PCR-Produkts und beruhen auf der Emission der Fluoreszenz. Die Taqman-Methode verwendet doppelt markierte Sonden zum Nachweis der angesammelten DNA, während die SYBR Green-Methode einen fluoreszierenden Farbstoff verwendet. Beide Methoden haben auch unterschiedliche Anwendungen in der Molekularbiologie.
