Der Hauptunterschied zwischen der Chromatofokussierung und der isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass die Chromatofokussierung eine Art von Säulenchromatographiemethode ist, die Ionenaustauscherharze verwendet, während die isoelektrische Fokussierung eine Art von Elektrophoresetechnik ist, die immobilisierte pH-Gradientengele verwendet.
Chromatofokussierung und isoelektrische Fokussierung sind zwei Techniken, die Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten trennen. Sowohl die Chromatofokussierung als auch die isoelektrische Fokussierung haben ein großes Auflösungsvermögen. Die Chromatofokussierung ist ein hochauflösendes Säulenchromatographieverfahren, während die isoelektrische Fokussierung ein elektrophoretisches Trennverfahren ist. Darüber hinaus verwendet die Chromatofokussierung kein elektrisches Feld, während die isoelektrische Fokussierung ein elektrisches Feld benötigt.
Was ist Chromatofokussierung?
Chromatofocusing ist eine Art Hochelutionschromatographie, die Proteine nach Unterschieden in ihrem isoelektrischen Punkt trennt. Es verwendet eine Ionenaustauscherharzsäule und einen intern entwickelten pH-Gradienten. Im Gegensatz zur isoelektrischen Fokussierung beinh altet die Chromatofokussierung kein elektrisches Feld. Die Chromatofokussierung ist eine leistungsstarke Reinigungstechnik, die sehr ähnliche Moleküle auflösen kann, die sich sogar nur um 0,02 pH-Einheiten unterscheiden. Daher eignet sich die Chromatofokussierung am besten als abschließender Polierschritt, wenn eine hohe Auflösung beim Trennen sehr ähnlicher Komponenten erforderlich ist.
Bei der Chromatofokussierung wird die Probe durch Mischen mit dem Startpuffer auf die Säule aufgetragen. Proteine, deren pH-Wert über ihrem isoelektrischen Punkt liegt, sind negativ geladen und bleiben nahe dem oberen Ende der Säule, während andere Proteine, deren pH-Wert unter ihrem isoelektrischen Punkt liegt, die Säule hinunterwandern. Das Protein mit dem höchsten isoelektrischen Punkt wird zuerst eluiert, während das Protein mit dem niedrigsten isoelektrischen Punkt zuletzt von der Säule eluiert wird. Diese Technik wird von mehreren Faktoren wie Proteinfällung und Linearität des pH-Gradienten beeinflusst.
Was ist isoelektrische Fokussierung?
Isoelektrische Fokussierung ist eine Technik, die verschiedene Moleküle basierend auf ihrem isoelektrischen Punkt trennt. Es wird auch als Elektrofokussierung bezeichnet. Diese Technik wird häufig zur Proteintrennung in einem Gel verwendet. Bei der isoelektrischen Fokussierung wird die Probe in Gele mit immobilisiertem pH-Gradienten (IPG) gegeben. IPG-Gel ist eine mit einem pH-Gradienten copolymerisierte Acrylamid-Gelmatrix. Die Proteine wandern zur Kathode, bis sie den pH-Bereich ihrer isoelektrischen Punkte finden. Wenn ein Protein den pH-Wert erreicht, der keine Nettoladung aufweist, hört die Migration auf und ergibt eine stationäre Bande. Ebenso ergibt jedes Protein eine Bande an einem Punkt im pH-Gradienten, der seinem isoelektrischen Punkt entspricht.
Abbildung 01: Isoelektrische Fokussierung
Die isoelektrische Fokussierung ist der erste Schritt der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Bei dieser Technik werden Proteine zuerst nach ihren isoelektrischen Punkten durch isoelektrische Fokussierung und dann nach ihrem Molekulargewicht durch SDS-PAGE getrennt.
Was sind die Ähnlichkeiten zwischen Chromatofokussierung und isoelektrischer Fokussierung?
- Chromatofokussierung und isoelektrische Fokussierung sind zwei hochauflösende Methoden.
- Beide basieren auf dem isoelektrischen Punkt von Proteinen.
- Diese Techniken verwenden einen pH-Gradienten.
- Beide Verfahren sind informativ für die Charakterisierung humaner Hämoglobinvarianten.
- Sie können Moleküle auflösen, deren pI-Werte sich um nur 0,02 pH-Einheiten unterscheiden.
Was ist der Unterschied zwischen Chromatofokussierung und isoelektrischer Fokussierung?
Chromatofocusing ist eine hochauflösende Säulenchromatographietechnik, die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt trennt. Im Gegensatz dazu ist die isoelektrische Fokussierung eine elektrophoretische Technik, die Proteine gemäß ihrem isoelektrischen Punkt durch Anlegen eines elektrischen Felds entlang eines in einer Kapillare gebildeten pH-Gradienten trennt. Das ist also der Hauptunterschied zwischen Chromatofokussierung und isoelektrischer Fokussierung.
Ein weiterer Unterschied zwischen der Chromatofokussierung und der isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass die Chromatofokussierung kein elektrisches Feld beinh altet, während die isoelektrische Fokussierung ein elektrisches Feld benötigt.
Zusammenfassung – Chromatofokussierung vs. isoelektrische Fokussierung
Chromatofokussierung und isoelektrische Fokussierung sind zwei ähnliche Techniken, die eine hohe Auflösungsfähigkeit von Molekülen haben, insbesondere von sehr ähnlichen Molekülen. Die Chromatofokussierung ist eine hochauflösende Säulenchromatographietechnik, während die isoelektrische Fokussierung eine Elektrophoresemethode ist. Im Gegensatz zur isoelektrischen Fokussierung beinh altet die Chromatofokussierung kein elektrisches Feld. Somit fasst dies den Unterschied zwischen Chromatofokussierung und isoelektrischer Fokussierung zusammen.
